组胺对老龄大鼠肠黏膜分泌型IgA分泌调节的影响

　　作者：席丰 高金生 杨书良

　　作者单位：河北省科技攻关基金资助项目 (河北工程大学医学院病理教研室，河北 邯郸 056029)

　　【摘要】 目的 通过测定小肠引流液中分泌型IgA(sIgA)的含量，观察组胺对老龄大鼠肠黏膜sIgA的分泌调节。方法 将20只老龄大鼠随机分为对照组(n=10)和实验组(n=10)。制模成功后，实验组大鼠立即给予小肠内100 ng/ml浓度组胺灌注，对照组大鼠用同样方法向小肠内灌注等量生理盐水，4 h后将肠引流液放入超低温冰箱保存待检。结果 对照组大鼠肠引流液中sIgA平均含量为(26.38±12.24)mg/L，实验组大鼠肠引流液中sIgA平均含量为(38.26±15.18)mg/L，对照组大鼠肠引流液中sIgA平均含量明显低于实验组(P<0.05)。结论 给予小剂量组胺肠内灌注，可促进老龄大鼠肠黏膜sIgA的分泌，增加肠液中sIgA的含量。

　　【关键词】组胺;老龄大鼠;肠黏膜免疫;分泌型IgA

　　肠黏膜免疫是由肠相关淋巴组织的细胞群组成的一种复杂的免疫防御体系，可有效地阻挡肠道内上百种寄生菌及其毒素向肠腔外组织、器官易位〔1〕。Walser〔2〕等报道，组胺受体阻断剂可降低肠黏膜免疫屏障的保护作用，容易导致肠道细菌易位或全身炎症反应综合症(SIRS)。而肠道给予小剂量组胺有保护肠黏膜屏障和抑制肠道细菌易位的作用〔3，4〕。目前，虽有许多组胺对肠黏膜免疫屏障保护作用方面的研究，但未见组胺对老龄大鼠肠黏膜免疫屏障保护作用方面的报道。本实验旨在通过小剂量、低浓度的组胺肠道内灌注对老龄大鼠肠黏膜分泌型IgA(sIgA)分泌的调节，探索组胺在老龄大鼠肠黏膜免疫屏障保护中的作用，为保护老年人肠黏膜屏障提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  实验动物 雄性24月龄SD大鼠20只，体重260～280 g，购于河北医科大学实验动物中心。实验前进行适应性饲养48 h，均未发现异常。

　　1.1.2  主要试剂 组胺(SigmaAldrich公司);羊抗大鼠sIgA单克隆抗体(AbD serotec公司);兔抗羊二抗(Kirkegard & Perry Laboratories公司);发光液(Santa Cruz公司);巯基乙醇(Promega公司);其他试剂均为国产优级纯或分析纯。

　　1.1.3  主要仪器 台式离心机(上海离心机械研究所);全自动酶标仪(奥地利);紫外光分光光度计(日本岛津公司);超低温冰箱(日本三洋);电泳仪、半干转槽(北京六一仪器厂);凝胶成像分析系统(南京捷达公司)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  实验前准备 蒸馏水配制组胺浓度为100 ng/ml，遮光低温保存备用。戊巴比妥钠用蒸馏水配置成1%浓度备用。

　　1.2.2  动物模型制备 20只雄性24月龄SD大鼠称重、编号后，随机分为正常对照组(n=10)和实验组(n=10)。所有大鼠实验前12 h禁食。实验时采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg)。取腹部正中切口，暴露十二指肠、空肠和回肠，在十二指肠和空肠交界处插管接微泵，在回肠末端接引流管。制模成功后，除对照组外，其他大鼠均立即用微泵分别给予小肠内灌注100 ng/ml浓度的组胺，前1 h灌注速度2 ml/h，后3 h灌注速度1 ml/h。对照组用同样方法向小肠内灌注等量的生理盐水。实验过程中肠引流液放置在冰盒中，4 h后将肠引流液移入-80℃超低温冰箱保存。实验过程中无大鼠死亡。

　　1.2.3  肠引流液sIgA检测 ①蛋白定量：采用福林酚试剂法(Lowry法)测定。②配胶：先将分离胶注入组装好的两层玻璃板中，在溶液上小心注入一层蒸馏水隔绝空气，放置30 min，待凝胶聚合后，倒掉上层蒸馏水，注入浓缩胶，放置30 min，置于电泳槽中。③电泳：将处理好的样品每孔按含蛋白15 μg加入上样孔中，上槽接负极，下槽接正极，恒流20 mA，待样品进入分离胶后改为40 mA。直到溴酚蓝迁移致距凝胶下端处时关闭电源，停止电泳。④转膜：电泳完毕后，切去浓缩胶，先取三张滤纸放在干转槽负极上，然后将凝胶、转移膜、三张滤纸依次放置，固定好后，恒流电泳45 mA，转移46 min。⑤封闭：转移结束后，将膜置于封闭液中，室温封闭2 h。⑥清洗：用PBS清洗，洗去多余的封闭液。⑦与一抗结合：滴加一抗(用5%BSA 1∶1 500稀释)，室温静置过夜。⑧洗膜：TweenPBS(PBS中加入0.05%Tween20)清洗3次，每次10 min，洗去未结合的一抗。⑨与二抗结合：滴加二抗(用5%BSA 1∶5 000稀释)，室温静置2 h。洗膜：TweenPBS清洗3次，每次10 min，洗去未结合的二抗。发光，显影：将电化学发光检测法(ECL)发光液1∶1混合后，滴加至膜上，并用底片曝光后，分别显影、定影。曝光的底片用凝胶成像分析系统拍照并测定积分光密度值。

　　1.3  统计学处理 数据用x±s表示，数据分析均采用两样本均数比较的t检验，方差不齐者采用t′检验，采用SPSS10.0软件进行统计分析。

　　2  结果

　　对照组大鼠小肠引流液sIgA平均含量为(26.38±12.24)mg/L;实验组大鼠肠引流液sIgA平均含量为(38.26±15.18)mg/L，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。实验表明给予肠道小剂量组胺对老龄大鼠肠黏膜分泌sIgA有促进作用。

　　3  讨论

　　肠黏膜屏障是机体抵御外来病原微生物入侵的重要屏障，肠黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、免疫屏障及生物屏障等组成〔5〕。其中，肠黏膜免疫屏障发挥着重要作用。sIgA是人类肠黏膜免疫屏障的主要抗体，由双体IgA〔IgA(d)〕、J链和分泌片(SC)共价结合构成。J链和IgA(d)由局部活化B细胞产生，SC由黏膜上皮细胞合成;SC与J链共价结合后与IgA(d)形成二聚体结构即sIgA。sIgA在肠黏膜局部免疫中发挥着重要作用，它们占据着黏膜表面，阻止细菌在肠黏膜表面停留、黏着、形成菌落〔6〕;可以和抗原结合形成大分子的复合物，阻止其进入细胞内。sIgA作为调理素与抗原结合，使细菌等微生物发生调理素化，增加黏膜表面单核巨噬细胞、中性粒细胞的表面吞噬作用;sIgA还能在小肠内结合和阻挡没有经过消化的大分子蛋白质穿过肠黏膜，避免引起机体的变态反应〔7，8〕。

　　组胺是肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒的标志物，是组氨酸在组氨酸酶(HDC)作用下，脱羧基后生成的一种作用广泛的单胺类物质，在胃肠道的含量尤为丰富。它可通过其H1R、H2R、H3R、H4R 4种受体参与多种生理功能调节，如胃肠分泌与蠕动、神经内分泌调节、免疫反应调节等。小剂量的组胺进入肠道后，可激活肠道中的肥大细胞使其脱颗粒释放组胺，释放的组胺又可激活邻近的肥大细胞脱颗粒，形成自身放大机制进行调节〔9〕。

　　老龄大鼠各种组织和器官都会出现不同程度的萎缩、功能下降，特别是免疫系统的功能下降明显。本研究证明，小剂量组胺肠道灌注后可增加老龄大鼠肠黏膜对sIgA的分泌，增强肠黏膜免疫屏障的保护作用，可能通过以下机制对sIgA进行分泌调节：①组胺具有扩张肠道细小动脉、改善肠道血液循环的作用，为肠黏膜免疫细胞提供更多的营养物质;②激活抗原提呈细胞(APC)，特别是在树突状细胞(DC)分化、成熟为DC1和DC2两种亚型的过程中尤为重要;③组胺通过H1R和H3R对DC1的分化起正性刺激作用，增强其细胞提呈抗原、合成促炎细胞因子及激活Th1细胞的能力〔10〕;④通过H2R促进IL5、IL6、IL10等抗炎细胞因子的合成，并诱导合成IL10的T细胞或Th2细胞增殖;⑤IL6对分泌sIgA的浆细胞在黏膜效应位点的定位、终末分化和增殖起关键作用，IL10能促进B淋巴细胞转化为浆细胞，提高sIgA 的分泌量〔11，12〕;⑥组胺是一种高效的类胰蛋白酶刺激剂，对肠黏膜sIgA 的分泌有正相调节作用〔13〕;⑦组胺是肠黏膜上皮细胞重要的营养素和刺激物，对肠黏膜上皮细胞的正常生理代谢起一定的促进作用。

　　此项研究提示，组胺是一种作用广泛的免疫调节剂，对老龄大鼠肠黏膜sIgA 的分泌有正相调节作用，可增强肠黏膜屏障的功能。如长期使用组胺受体拮抗剂治疗胃肠疾病，会降低肠黏膜免疫屏障的保护功能，增加肠道细菌易位、肠源性脓毒血症的机会，甚至诱发SIRS和多器官功能衰竭综合征。

　　【参考文献】

　　1  Deitch EA.Bacterial translocation or lymphatic drainage of toxic products from the gut:what is important in human beings?〔J〕.Surgery，2002;131(3):2414.

　　2  Walser EM，Nealon WH，Marroquin S,et al.Sterile fluid collections in acute pancreatitis:catheter drainage versus simple aspiration〔J〕. Cardiovasc Intervent Radiol，2006;29(1):1027.

　　3  吕艳青，栗原博.组胺在机体免疫反应中的作用〔J〕.中国药理学通报，2007;23(1)：137.

　　4  杨书良，刘惠民，戴景芳，等.组胺对失血大鼠模型肠黏膜屏障的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2008;28(23)：23035.

　　5  杨书良，李兰梅，陈育民.肠黏膜屏障的构成与功能研究进展〔J〕.临床荟萃，2008;23(24)：180911.

　　6  Rhee KJ，Sethupathi P，Driks A,et al.Role of commensal bacteria in development of gutassociated lymphoid tissues and preimmune antibody repertoire〔J〕.J Immunol，2004;172(2):111824.

　　7  Lamm ME，PhillipsQuagliata JM.Origin and homing of intestinal IgA antibodysecreting cells〔J〕.J Exp Med，2002;195(2):56.

　　8  Golby SJ， Spencer J.Where do IgA plasmma cell in the gut come from〔J〕? Gut,2002;51(2):1501.

　　9  谢 华，何韶衡.组胺对肥大细胞激活的研究〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志，2004;24(3)：168.

　　10  Takahashi HK,Iwagaki H,Mori S,et al.Histamine inhibits lipopolysaccharideinduced interleukin(IL)18 production in human monocytes〔J〕. Clin Immunol,2004;112(1):304.

　　11  Mazzoni A，Young HA，Spitzer JH,et al.Histamine regulates cytokine production in maturing dendritic cells,resulting in altered T cell polarization〔J〕. J Clin Invest，2001;108(12):186573.

　　12  曾常茜.分泌型IgA在黏膜抗感染中的作用〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2005;6(1)：335.

　　13  谢 华，何韶衡.组胺对人结肠肥大细胞类胰蛋白酶释放的调节作用〔J〕.基础医学与临床,2005;25(1):35.