人核心蛋白聚糖基因靶向肺癌细胞特异性表达载体的构建及鉴定

　　　作者：吕俊锋1 杜珍武 张玉成 张桂珍 作者单位：1 吉林大学第二医院放射线科 (吉林大学中日联谊医院中心实验室,吉林 长春 130033)

　　【摘要】 目的 构建调控人核心蛋白聚糖(DCN)基因特异性基因表达载体，为进一步应用该基因进行肺癌靶向治疗的研究奠定实验基础。方法 利用特异性引物，应用PCR技术从人外周血基因组中扩增肺癌细胞特异性表达的人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂的启动子,利用基因重组技术将该启动子插入真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)，替换该载体的CMV启动子与增强子序列，从而构建成由人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂基因的启动子启动基因表达的基因表达载体。将人DCN基因通过基因重组技术插入到上述载体人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂基因启动子的下游，PCR产物通过测序鉴定核苷酸序列，重组载体通过限制性酶切进行鉴定。结果 PCR扩增的人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂的启动子片段长度为1 250 bp;该启动子经测序获得的核苷酸序列与GenBank上该基因上游5′末端转录调控区的序列完全一致;重组载体的酶切鉴定结果显示该启动子成功插入到pcDNA3.1(+)载体，并替换CMV启动子与增强子序列，人核心蛋白聚糖基因成功插入该载体。结论 成功构建由人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂基因启动子调控人核心蛋白聚糖基因表达载体。

　　【关键词】 核心蛋白聚糖;人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂;聚合酶链反应;基因表达

　　肺癌的分子靶向药物治疗是近年新兴的一种治疗手段，具有高度选择性地杀死肿瘤细胞而不杀伤或仅很少损伤正常细胞的特点，然而，恰恰由于靶向治疗是为攻击特异性靶分子而设计，所以须找到合适靶点才能发挥其疗效。研究发现核心蛋白聚糖(decorin，DCN)在肿瘤细胞的生长转移过程中发挥重要作用，具有较好的抑制肿瘤细胞生长的作用〔1〕。因此，运用特定的基因表达调控元件,使DCN基因特异地在肿瘤细胞中表达,从而提高DCN基因治疗安全性。人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂(human secretoryleukoprotease inhibitor，hSLPI)是由呼吸道及生殖道黏膜上皮分泌的蛋白质，在非小细胞肺癌(NSCLC)中高表达，hSLPI作为基因启动子具有相对更好的特异性，该基因启动子控制的特异表达及杀伤作用已在动物实验中得到证实〔2〕。本实验采用基因克隆技术从人外周血白细胞的基因组中钓取SLPI启动子片段构建并鉴定pcDNA3.1hSLPIdecorin的真核表达体系,为进一步研究decorin靶向基因治疗肺癌奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人肺腺癌A549细胞、质粒pcDNAdecorin、细菌克隆宿主大肠杆菌JM109 和质粒pcDNA3.1来自本实验室。各种限制性内切酶、TaqDNA 聚合酶、T4DNA 连接酶购于大连宝生物工程有限公司。质粒小提试剂盒、DNA marker 购自天根生化科技有限公司。DNA凝胶回收试剂盒购自维特洁生化技术有限公司。抗人DCN单克隆抗体购于R&D公司;Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司;G418购于宝泰克生物工程公司。

　　1.2 引物设计

　　根据GenBank 中SLPI 基因的cDNA序列，上游5′末端转录调控区的序列设计一对引物,上游引物：5′TTCGACGCGTCTCACTGCAGCCTCAAAC3′并在5′端引入MluⅠ酶切位点;下游引物：5′TTCTAGCTAGCGGTGAAGGCAGGAGTGAC3′并在5′端引入NheⅠ酶切位点。由上海生工公司合成。

　　1.3 SLPI 基因启动子的克隆与鉴定

　　取新鲜的人外周血2 ml，按试剂盒说明提取细胞基因组DNA，并以此为模板,应用TaqDNA 聚合酶和上述引物进行PCR 扩增SLPI 基因启动子序列。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，58℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 40 s，共35 个循环,最后72 ℃延伸10 min。PCR 产物通过1 %琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定。DNA 凝胶回收试剂盒回收全部PCR产物,得到的目的片段克隆到pcDNA3.1载体中,并转化大肠杆菌JM109，经蓝白筛选,随机挑取白色菌落,摇菌后提取质粒,以MluⅠ和NheⅠ双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳,进行酶切鉴定，鉴定正确后得到pcDNA3.1SLPI菌株,再送交上海生工测序中心鉴定 。

　　1.4 双酶切pcDNA3.1decorin和pcDNA3.1hSLPI连接并转化

　　用EcoR I、Xba I双酶切质粒pcDNA3.1decorin，凝胶回收DCN基因片段，通过T4连接酶定向克隆入Mlu I和Nhe I 双酶切测序正确的载体pcDNA3.1hSLPI 基因启动子SLPI的下游，连接产物转化到已置备好的感受态JM109菌中,并且涂布在含有氨卞青霉素的LB平板上,过夜后挑取单克隆菌,摇床过夜,质粒小提试剂盒提取重组质粒pcDNA3.1hSPLIdecorin。

　　1.5 质粒pcDNA3.1hSLPIdecorin的酶切鉴定

　　pcDNA3.1hSPLIdecorin 阳性重组克隆通过Mlu I 和Nhe I、 EcoR I和Xba I酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，进行初步鉴定。

　　2 结 果

　　2.1 SLPI 基因启动子的克隆与鉴定

　　2.1.1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

　　见图1,在约1 250 bp处获得SLPI 基因启动子单一目的条带。M:DNA分子量标准DL2000;1:SLPI启动子PCR产物图1 SLPI 启动子PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱

　　2.1.2 酶切鉴定

　　pcDNA3.1SLPI 阳性重组克隆通过Mlu I 和Nhe I 双酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,结果见图2，在约1 250 bp处切出目的片段。M:DNA 分子量标准DL2000;1：未经酶切的pcDNA3.1 SLPI;2:Mlu I和Nhe I 双酶切pcDNA3.1SLPI图2 pcDNA3.1SLPI 酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图谱

　　2.1.3 序列测定

　　经酶切、PCR鉴定正确的质粒进行测序。将测序结果与GenBank 中的SLPI 基因上游5′末端转录调控区序列比对,序列完全一致,测序结果为：GGGGGACACCAGATGGCTGGCACTAGAAGGCACAGTCGAGGCT　　GATCAGCGGGTTTAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCC　　ACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCCACCACACTGGACTAGTGG　　ATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACGCTAGCGGTGA　　AGGCAGGAGTGACTCTGATGGCCAATGCCAAACCTCACTATTTA　　TTCTTTCACCAGTGGGTGTGGCCCCACCAGAATTCTCTCGGCCT　　CTCCCAGCTACTATTGCATAAGCAGGAAACGTAGCCAGAGACC　　AGAAATCCTGACACCAAGGAGATTGTTTATCTTTCCTATGCCAG　　GTAAGGCTATGAGGCCAACACAGCAACTATCAGAAAAGAAAG　　GGAAGAGATTGGCCTGGGAAGTTGGTTGATTAAAGAGGCCATC　　TCAGTGTCCATCTGAGCCCTAAACATCACAAGATCCCAGGCCA　　TTAGCCTTATAGGTGGAGAGAGGGAAGAAGTGGTCAATTGCAA　　AGGTGCTACCCGGACCTGGAACTAAAACCAGACACAGACTC　　CCTGCTGAGACTTTGTGCAATACATTCTATTCTCACATTGCTAA　　TTCTGATTCTCACATTACTGGACTCTCAGGCATTGTGAAACTCT　　GCTGATTACTCAATGCAGTTTCTTTCTCAAAAGTTCAGCTCGTT　　CAACCAACTGATACTTAGTTCCCTGAAATATTTACACCGTTATA　　TCCCCAGTGCCTGTTCTGTGCCTGACACAGGAAAAGCACTCAC　　AAATGAAAGCTGAAGAAGAGCTCCGCTCTCCACAAATCTCTCT　　GGAGCTCAGTTGTCTCAGCTGTGAAATGAAATGATACTAACAA　　GTCAGCCCTTCTCAGAGGGTTATGAAATTAAGGGCATGAAAGG　　GACTCTGAATGAAAAGAACAATGAATAGTATCCCTTCCCACTA　　AAGAGAATTGAAATGAATCTGAGATAAAGGGGGAAAGCAGCT　　CATCAGTCACTGTAATCTACATTTAGCTGTGAGATAATTTGAAG　　ATCTTAAAGGATGGCTTCCTAAATTCCCCAAAATCCCTTACAG　　ATCTCACATGACAGCAAAAAATTAAACCCATTCTTATTTGTTAA　CAAGT。

　　2.2 重组质粒pcDNA3.1hSLPIdecorin的酶切鉴定

　　重组质粒pcDNA3.1hSLPIdecorin 经Mlu Ⅰ和Nhe Ⅰ、EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切后1%琼脂糖凝胶电泳,结果可见酶切下1 000 bp的DCN基因片段及1 250 bp处获得SLPI 基因启动子的条带，见图3。M:DNA分子量标准DL2000;1：未经酶切的pSLPIEGFP;2：Mlu Ⅰ和Nhe Ⅰ、 EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切pcDNA3.1hSLPIdecorin图3 pcDNA3.1hSLPIdecorin酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图谱

　　3 讨 论

　　DCN是在细胞外基质中存在的小分子蛋白聚糖，1978年首次由美国国立卫生研究院骨科研究所的Fisher 教授分离、纯化。1986年Krusius 等〔4〕通过提取人胚胎成纤维细胞系IMR290RNA、构建DNA 文库,成功克隆DCN 基因并测序鉴定。研究发现，DCN 在体外可抑制各种组织来源的肿瘤细胞增殖，尤其是hNSCLC细胞，国外学者先给裸鼠接种A431 肺鳞状细胞癌细胞株,出现接种的瘤体后，多次瘤体内注射DCN基因的腺病毒载体。结果移植瘤体生长减缓，瘤体与正常组织分界变清楚，并且在鳞状细胞癌的移植瘤体内出现了数个角化珠〔5〕。也就是DCN基因在抑制肿瘤细胞生长的同时，还有促进细胞分化的作用。Araki 等〔6〕进一步报道，巨细胞病毒介导的DCN cDNA转染转移性乳腺癌细胞株MDAMB231，能表达DCN，可以抑制肿瘤细胞的生长、运动和转移，骨转移下降了90%，这些结果表明DCN对肿瘤转移有预防作用，并可能最终导致对转移性乳腺癌的更好的治疗。

　　文献〔4〕显示SLPI 基因在各种NSCLC患者的癌组织中呈过量表达,在肝中表达极弱,相比于其他肺癌特异性启动子,SLPI 基因启动子调控的肺癌组织类型更广。Maemondo等〔7〕应用该启动子调控肿瘤选择性完全复制型腺病毒治疗NSCLC取得较好的特异抗瘤效果，该研究为寻求针对肺癌的更有效的肿瘤基因治疗、最大限度地避免对正常组织的损伤打下基础。

　　为寻求针对肺癌的更有效的肿瘤基因治疗,最大限度地避免对正常组织的损伤,本研究选用SLPI基因启动子作为NSCLC基因治疗的靶开关。通过PCR 方法从人外周血基因组中钓取1.2 kb 的SLPI 启动子,测序结果证实与GenBank上SLPI基因上游5′末端转录调控区的序列完全一致。实验成功构建SLPI 启动子调控下的DCN报告基因表达载体，最终成功构建了真核表达载体pcDNA3.1hSLPIdecorin,这为进一步研究DCN靶向治疗肺癌作用及其抑癌机制奠定了基础。

　　【参考文献】

　　1 Reed CC，Gauldie J，Iozzo RV.Suppression of tumorigenicity by adenovirusmediated gene transfer of decorin〔J〕.Oncogene，2002;21(23)：368895.

　　2 Nukiwa T，Suzuki T，Fukuhara T,et al.Secretory leukocyte peptidase inhibitor and lung cancer〔J〕.Cancer Sci，2008;99(5):84955.

　　3 Kr usius T，Ruoslahti E.Primary structure of an extracellular matrix proteoglycan core priein deduced from clone cDNA〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1986;83(20):76837.

　　4 Ameshima S，Ishizaki T，Demura Y,et al. Increased secretory leukoprotease inhibitor in patients with nonsmall cell lung carcinoma〔J〕.Cancer,2000;89(7):1448.

　　5 Reed CC，Gauldie J，Iozzo RV.Suppression of tumorigenicity by adenovirus mediated gene transfer of decorin〔J〕.Oncogene，2002;21(23)：368895.

　　6 Araki K，Wakabayashi H，Shintani K,et al.Decorin suppresses bone metastasis in a breast cancer cell line〔J〕.Oncology，2009;77(2):929.

　　7 Maemondo M，Saijo Y,Narumi K,et al.Gene therapy with secretory leukoprotease inhibitor promotercontrolled replicationcompetent adenovirus for nonsmall cell lung cancer〔J〕.Cancer Res，2004;64(13)：4611.