人参皂苷Rg1、Rb1对淀粉样前体蛋白分泌酶代谢途径的影响

　　　作者：魏翠柏,贾建平,王芬,贾龙飞 作者单位：首都医科大学宣武医院神经内科,北京 100045

　　【摘要】 目的 观察人参皂苷Rg1、Rb1对淀粉样前体蛋白代谢途径中α分泌酶活性和基因表达的影响。方法 用转染突变型PS1(ML46L)和野生型PS1的CHO细胞,通过荧光酶标技术检测α分泌酶活性,Western blot免疫印迹、RT-PCR技术检测α分泌酶基因ADAM9、ADAM10的蛋白和RNA表达。结果 转染突变型PS1 ML46L组α分泌酶活性较转染野生型PS1(WT组)低(P<0.05),加用人参皂苷Rg1、Rb1后转染突变型PS1ML46L组α分泌酶活性较未加用组不同程度增高(P<0.05),同时ADAM9、ADAM10的蛋白及RNA表达较未加用组有不同程度增多(P<0.05)。结论 人参皂苷Rg1、Rb1均可不同程度增加α分泌酶中ADAM9、ADAM10基因表达,提高α分泌酶活性,且人参皂苷Rg1调节作用优于人参皂苷Rb1。

　　【关键词】 人参皂苷Rg1;人参皂苷Rb1;淀粉样前体蛋白分泌酶;阿尔茨海默病

　　Effect of Ginsenoside Rg1 and Rb1 on Secretase in Metabolic Pathway of Amyloid Precursor Protein WEI Cui-bai, JIA Jian-ping, WANG Fen, et al　Department of Neurology, Xuanwu Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100045, China Abstract：Objective To study effects of Ginsenoside Rg1, Rb1 on activity and genetic expression of alpha secretase in the progress of metabolism of APP. Methods Chinese hamster ovary (CHO) cell line transacted by mutant PS1 (ML46L) genes and wild type PS1 genes was used. The activity of alpha secretase was tested by fluorometric reaction. The expression of ADAM9 and ADAM10 was analysis through western blotting and RT-PCR. Results The activity of alpha secretase was increased significantly in Ginsenoside Rg1, Rb1 group than that without Ginsenoside group (P<0.05). The protein and RNA expression of ADAM9 and ADAM10 treated with Ginsenoside was higher than that untreated (P<0.05). Conclusion Both Ginsenoside Rg1 and Rb1 could increase the protein and RNA expression of ADAM9 or ADAM10, upregulate the activity of alpha secretase. Ginsenoside Rg1 is more effective than Ginsenoside Rb1.

　　Key words：Ginsenoside Rg1;Ginsenoside Rb1;secretase of amyloid precursor protein;Alzheimer’s Disease

　　β-淀粉样蛋白(beta-amyloid protein,Aβ)在细胞外沉积构成的老年斑是阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)主要病理学特征之一。Aβ由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)经α和β两种分泌酶裂解产生。有效地调整分泌酶活性和功能是防治AD的重要途径。

　　人参皂苷Rg1、Rb1是人参的主要有效成分。有报道,人参皂苷Rg1、Rb1具有抗氧化、抑制凋亡、抗兴奋性氨基酸毒性及有效抑制细胞外APP增多诱导的细胞凋亡等多种保护作用[1-2]。本研究拟研究人参皂苷Rg1、Rb1对APP代谢中分泌酶的影响,进一步探讨人参皂苷Rg1、Rb1对AD可能的防治作用。

　　1 实验材料

　　1.1 细胞来源及培养

　　突变型PS1ML46L和野生型APP751双转染细胞系(PS1ML46L/APP751)、野生型PS1和野生型APP751双转染中国仓鼠卵巢瘤细胞系(TW组)、中国仓鼠卵巢瘤细胞系(CHO)由美国哈佛大学医学院神经疾病研究中心构建,经中国医学科学院基础研究所梁平教授转赠。细胞均在37 ℃含有5%CO2的饱和湿度下培养,CHO细胞系培养用高糖DMEM,加入20%FBS,其中PS1ML46L/APP细胞培养基外加250 μg/mL G418、2.5 μg/mL Puromycin。

　　1.2 试剂及药物

　　天然药物单体标准品人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1均购自中国药品生物制品检定所。ADAM9小鼠抗人单克隆抗体(批号ENM0139091)、ADAM10小鼠抗人单克隆抗体(批号FAL02)均购于美国RD公司。辣根过氧化物酶(HRP)耦联羊抗小鼠二抗和羊抗兔二抗(批号73452)。RT-PCR试剂盒(批号18080-051)购于美国Invitrogen公司。总RNA提取试剂盒(批号18341)购于美国Promega公司。α分泌酶活性检测试剂盒(批号FP001)为美国R&D生物公司出品。

　　2 实验方法

　　2.1 总RNA提取

　　按照RNAgents Total RNA Isolation System(Promega)试剂盒和superscriptTIM Ⅲ First-Strand Synthesis for RT-PCR试剂盒操作,提取总RNA并完成RT-PCR。Beta-actin扩增产物作为内参,所用引物由上海Sangon生物工程服务有限公司合成。引物的碱基序列及扩增的目的基因片段长度如下：①BACE1(上游：5’-AAG ATG TTC GGA ATG TGG GT-3’;下游：5’-CAG GGC TAC TAT GTG GAG ATG A-3’)。②ADAM9(上游：5’-AGT TCC TGG ACC CTG ATG C-3’;下游：5’-TTC TCC CGC AGA CCC GCT AC-3’)。③ADAM10(上游：5’-CAC TTG GCT TAT GTT CCT A-3’;下游：5’-CTG CTT GGC CTA TGT CTT C-3’)。用Fluochemy5500凝胶图像分析仪采集图像,经Image Master TMTotal Lab Software图像分析软件计算条带光密度值。

　　2.2 α分泌酶活性荧光酶标测试

　　按照α分泌酶活性荧光酶标检测试剂盒中的操作说明。培养细胞经胰蛋白酶消化,以1 000 g离心10 min,弃上清。以50×106 cells/mL比例加入冷1×Cell Extraction Buffer裂解细胞。冰浴20 min后,10 000 g离心1 min,取上清液,放置冰上备用。在黑色避光微量培养板各孔内依次加入50 μL细胞裂解液(蛋白量40 μg),50 μL 2×Reaction Buffer及5 μL酶促底物。轻轻敲动培养板混匀,37 ℃避光孵育2 h。利用荧光全自动定量绘图酶标仪,在激发波长335 nm、收集波长495 nm检测样本。实验设6个空白对照,分别为空板、不加细胞裂解液、不加酶促底物。

　　2.3 Western blot免疫印迹

　　各细胞系均以相同密度培养,加入预冷的RIPA裂解缓冲液,将裂解物以14 000 r/min 4 ℃离心30 min,收集上清。30 μg蛋白经10%SDS-PAGE电泳分离后,将蛋白转移至PVDF膜。甲醇浸泡15 s后干燥1 h,5%脱脂奶粉封闭1 h,按照1∶1 000加入ADAM9一抗(或ADAM10),同时1∶500加入小鼠抗人β- actin单克隆抗体,4 ℃过夜。再加入HRP耦联羊抗小鼠二抗(1∶2 000)、羊抗兔二抗(1∶2 000),室温孵育2 h,用化学发光法(ECL)检测结果。蛋白表达条带通过Bandscan图像分析软件进行分析。

　　2.4 统计学方法

　　实验结果采用SPSS11.5分析软件中方差分析进行统计。其中免疫印迹、RT-PCR图像光密度(OD)值均与突变型基因细胞组最大值相比,进行数据的标准化处理后再进行数据统计分析。

　　3 结果

　　3.1 α分泌酶活性测试结果

　　加用人参皂苷Rg1、Rb1组与未加用组组间差异有统计学意义(F=2.975,P<0.05),其中转染突变型PS1ML46L(control)组α分泌酶活性较转染野生型PS1(WT组)明显降低(P<0.05),提示PS1基因突变可能导致α分泌酶活性下降。其中人参皂苷Rg1组较人参皂苷Rb1组增高明显。

　　3.2 分泌酶RT-PCR检测结果

　　结果显示,ADAM9扩增条带长度约为525 bp,ADAM10扩增条带约为394 bp。加用人参皂苷Rg1、Rb1组与未加用组组间差异有统计学意义(FADAM9=3.294,P=0.011;FADAM10=9.345,P=0.000)。其中转染突变型PS1ML46L细胞ADAM9、ADAM10 mRNA表达较转染野生型PS1(WT组)明显降低,统计学分析差异有统计学意义(P<0.05),提示PS1基因突变可能导致α分泌酶mRNA表达下降。

　　转染突变型PS1ML46L细胞中加用人参皂苷Rb1、Rg1组与未加用人参皂苷组相比,ADAM9 mRNA表达增多(P<0.05)。

　　ADAM10 mRNA表达检测中,转染突变型PS1ML46L细胞中加用人参皂苷Rb1、Rg1组中的ADAM9 mRNA表达亦高于未加用人参皂苷组(P<0.05)。

　　3.3 分泌酶测试结果

　　ADAM9蛋白条带在分子量84 kDa左右,ADAM10蛋白条带在分子量60 kDa左右(见图1)。不同组细胞分析结果显示各组组间差异有统计学意义(FADAM9=4.543,P<0.05;FADAM10=4.543, P<0.05)。突变型PS1ML46L组ADAM9蛋白表达量较转染野生型PS1(WT组)少(P<0.05)。加用人参皂苷Rg1组与未加用组的突变型PS1ML46L细胞中ADAM9蛋白表达量有不同程度增多。人参皂苷Rb1组ADAM9蛋白表达量也较突变型PS1ML46L组高,但无统计学意义(P>0.05)。

　　突变型PS1ML46L组ADAM10蛋白表达量较转染野生型PS1(WT组)少(P<0.05)。加用人参皂苷Rg1、Rb1组与未加用组的突变型PS1ML46L细胞中ADAM10蛋白表达量有不同程度增多(P<0.05)。

　　4 讨论

　　APP代谢途径紊乱是导致AD发病的核心环节[3],α、β分泌酶功能是决定APP代谢途径的关键因素。α分泌酶作用产生可溶性分泌型氨基末端多肽片段sAPPα及富含83个氨基酸残基的羧基端跨膜片段C83。可溶性APP对神经细胞具有营养和保护作用,并在一定程度上抑制致病性β淀粉样蛋白的生成[4]。β分泌酶途径是AD病理机制中APP主导代谢途径。在此途径中产生大量致病性的Ab1-42、Ab1-40引发免疫炎症反应、过氧化等病理机制,选择性地使神经细胞凋亡而导致AD。现代研究证实,α分泌酶是由解聚素金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease,ADAM)家族中ADAM9、ADAM10、ADAM17三种多种聚素金属蛋白酶家族成员组成的复合物,其中ADAM9、ADAM10被认为是α分泌酶中的主要活性成分[5-8]。

　　本实验结果显示,转染突变型PS1细胞组较转染野生型PS1细胞组α分泌酶活性低,免疫印迹实验结果显示,转染突变型PS1细胞组ADAM9、ADAM10较转染野生型PS1细胞组低,提示PS1突变可能影响α分泌酶的功能和蛋白表达。先前在探讨家族遗传性AD病理机制中部分实验结果,支持AD相关基因突变可能导致分泌酶活性变化。也有实验证明PS1突变可控制β分泌酶对APP裂解[9]。Levy等[10-11]实验结果也显示,Flemish 692型APP基因突变可抑制α分泌酶的活性,导致Aβ总量增加和α分泌酶裂解APP的中间产物P3减少。本研究结果证实PS1ML46L位点突变可能引发α分泌酶活性改变。

　　免疫印记实验中,人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1组ADAM10蛋白表达量和人参皂苷Rb1组ADAM9蛋白表达量均较相应突变型PS1ML46组高,提示这些天然药物单体有上调α分泌酶基因表达的作用。其中人参皂苷Rg1对ADAM10、ADAM9两种蛋白表达均有上调作用,而Rb1仅对ADAM10蛋白有影响,提示相同人参有效成分中不同的单体物质作用在相同功能蛋白家族的不同成员间有一定选择性。α分泌酶活性检测中,人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1不同程度增加突变基因转染细胞中α分泌酶活性,其机制可能与两种中药单体引起ADAM10、ADAM9蛋白表达增多有关。结合先前细胞荧光免疫实验中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1降低Aβ42表达,推测人参皂苷Rg1、Rb1可能通过提高 ADAM10、ADAM9基因表达,增强APP的α分泌酶代谢途径间接减少Aβ42产生而抑制细胞凋亡。α分泌酶活性检测中人参皂苷Rg1、Rb1对α分泌酶活性均有增强作用,可通过增加α分泌酶活性来抑制Aβ42增多以及抑制其导致的细胞凋亡,进一步佐证了天然药物单体可通过增强Aβ生成途径中α分泌酶代谢途径间接降低Aβ诱导的细胞凋亡作用。

　　【参考文献】

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