吡格列酮对游离脂肪酸作用下βTC3细胞GPR40表达的干预作用

　　作者：张贝蕾，杨立勇 作者单位：福建省教育厅科研项目(JB06240),福建医科大学教授发展基金(JS6034) 福建医科大学附属第一医院内分泌科、福建医科大学 代谢病研究室，福州 350005

　　【摘要】 目的 探讨游离脂肪酸(FFA)作用下胰岛βTC3细胞G蛋白受体40(GPR40)mRNA表达的改变以及吡格列酮(Piog)对此改变的干预作用。 方法 以βTC3细胞为研究对象，分为对照组及FFA组(0.25，0.5及1 mmol/L)。半定量RTPCR方法检测GPR40的表达。用不同浓度的Piog(0，0.1，1，10 μmol/L)预孵育βTC3细胞6 h，加入1 mmol/L FFA继续孵育24 h，半定量RTPCR方法检测GPR40的表达。 结果 (1)FFA孵育12 h后，各组间GPR40的表达差别无统计学意义。(2)FFA孵育24 h后，与对照组比较，0.25 mmol/L FFA组GPR40的表达无差异，但0.5 mmol/L和1 mmol/L FFA组GPR40表达下调(P<0.05);0.5 mmol/L与1 mmol/L FFA组比较GPR40表达差别无统计学意义。(3)与1 mmol/L FFA组比较，0.1 μmol/L Piog+1 mmol/L FFA组GPR40 mRNA表达无差异，而1 μmol/L Piog +1 mmol/L FFA组和10 μmol/L+1 mmol/L FFA组GPR40表达升高(P<0.01)。 结论 长期高浓度FFA作用能够下调βTC3细胞GPR40的表达，而Piog有助于保护或减轻FFA水平异常导致的βTC3细胞GPR40表达的损害。

　　【关键词】 噻唑烷二酮类; PPARγ; 脂肪酸类; 糖尿病，2型; 受体，G蛋白偶联

　　Effects of Pioglitazone on the Expression of βTC3 Cell GPR40 Induced by Free Fatty Acids

　　ZHANG Beilei, YANG Liyong

　　Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital; Laboratory of Metabolism Disease,

　　Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate gene expressions of GPR40 in βTC3 cells induced by free fatty acids(FFA) and the intervention effect of pioglitazone(Piog) on those expressions. Methods βTC3 cells studied in the experiment were subject to different treatments with a blank and three concentrations of FFA (0.25, 0.5 and 1.0 mmol/L). Semiquantitative RTPCR analysis was used to determine the RNA expression level of GPR40 in βTC3 cells after 12 hours and 24 hours respectively. Afterwards, βTC3 cells were preincubated with different concentrations of Piog(0, 0.1, 1, 10 μmol/L)for 6 hours, and 1 mmol/L FFA was then added and the cells were incubated for another 24 hours. The RNA expression level of GPR40 was determined by semiquantitative RTPCR at last. Results (1) After the cells were incubated with FFA of different concentrations for 12 hours, there was no statistically significant difference among all the groups. (2) After the 24hour incubation, no difference was shown between the group with 0.25 mmol/L FFA and the control group. But compared to the control group and the group with 0.25 mmol/L FFA, the expression of GPR40 in βTC3 cells in both groups with 0.5 mmol/L FFA and that with 1 mmol/L FFA decreased after the 24hour incubation (P<0.05). There was, however, no statistical difference between the group with 0.5 mmol/L FFA and that with 1 mmol/L FFA. (3)Though no statistically significant difference was found between the group with 0.1 μmol/L Piog+1.0 mmol/L FFA and that with 1.0 mmol/L FFA, the RNA expression level of GPR40 in both the group with 1 μmol/L Piog+1.0 mmol/L FFA and that with 10 μmol/L Piog+1.0 mmol/L FFA increased compared to the group with 1 mmol/L FFA (P<0.01). Conclusion The expression of GPR40 in βTC3 cells may be inhibited by longterm administration of FFA of high concentration, while Piog can help to protect the expression of GPR40 against FFAinduced impairment in βTC3 cell.

　　KEY WORDS: thiazolidinediones; fatty acids; PPAR gamma; diabetes mellitus, type 2; receptors, Gproteincoupled

　　游离脂肪酸(FFA)对胰岛β细胞胰岛素分泌的影响具有双向性，短期作用刺激其分泌而长期作用则损害胰岛素分泌功能[12]，但其机制尚不清楚。近年来的研究表明，孤儿型G蛋白偶联受体40(GPR40)是中、长链FFA的特异性受体并在胰岛β细胞膜上大量表达[3]。中、长链FFA能够通过活化GPR40从而促使胰腺分泌胰岛素(GSIS)[45]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是一类由配体激活的核转录因子，近年来已经发现其在胰岛β细胞上高度表达,可保护β细胞免于FFA介导的损害[4,6]。本研究观察FFA与过氧化物酶体增殖物激活受体γ激活剂吡格列酮(Piog)对体外培养的胰岛βTC3细胞GPR40表达影响，以期为拮抗FFA的脂毒性作用以保护胰岛β细胞，以及进一步评估PPARγ受体对糖、脂代谢的调控作用提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞和试剂

　　小鼠胰岛β细胞瘤细胞系的βTC3细胞(福建医科大学分子医学中心馈赠)。DMEM培养基(美国GIBCO公司)，油酸和棕榈酸均(美国Sigma公司)，Piog(恒瑞集团江苏德源药业有限公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 FFA溶液的制备

　　FFA贮备液中油酸与棕榈酸的比例为2∶1。溶解所需剂量的油酸和棕榈酸于10 mL 99%酒精中，振摇1 h。每10 mmol/L FFA加入40 μL的NaOH(10 mol/L)，混匀，置于通风橱中过夜干燥。加入10 mL蒸馏水，加热溶液至呈透明皂液样时，加入40 mL冰冷的10%小牛血清白蛋白，混匀。经0.22 μm CA过滤器过滤消毒后将FFA贮备液存于-20 ℃。

　　1.2.2 Piog溶液的制备

　　量取Piog 5 mg，用DMSO溶液溶解稀释配制成1 mmol/L的母液，过滤除菌，4 ℃保存，使用前用DMEM培养液稀释成所需浓度，并使培养液中DMSO的终浓度不高于0.01%。

　　1.2.3 细胞培养与分组

　　βTC3细胞以1×104 mL-1的浓度接种于6孔培养板中培养，进入对数生长期后进行干预实验。

　　1.2.3.1 FFA干预试验

　　将细胞分成4组：空白对照组(只加含10%胎牛血清的DMEM培养液)，0.25 mmol/L FFA组，0.5 mmol/L FFA组，1 mmol/L FFA组。分别加入含不同浓度的FFA或不含FFA(对照组)的DMEM培养液培养12 h或24 h。

　　1.2.3.2 Piog与FFA共同干预试验

　　将细胞分成4组：1 mmol/L FFA组(不加Piog)，0.1 μmol/L Piog+1 mmol/L FFA组，1 μmol/L Piog+1 mmol/L FFA组，10 μmol/L Piog+1 mmol/L FFA组。各组先加入不同浓度的Piog培养6 h，再加入FFA并使其终浓度为1 mmol/L，继续培养24 h。

　　1.2.4 细胞总RNA的制备

　　细胞用PBS冲洗两遍后，采用Trizol一步法提取细胞总RNA，并取少量样品作紫外扫描分析和琼脂糖电泳分析，其余-80 ℃保存。

　　1.2.5 RTPCR试验

　　1.2.5.1 RTPCR引物

　　引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。

　　GPR40(255 bp)：

　　F1：5’AACTTGTTAGCCATCCGAGGC3’

　　R1：5’TTCCGTTTGTGGCTCAGGC3’

　　F2：5’TTGCCTTGGCCCACTTTG3’

　　R2：5’GAGCCATTCACGGGTATGTTG3’

　　内对照小鼠β肌动蛋白(βactin，291 bp)：

　　F：5’GCTACAGCTTCACCACCACAG3’

　　R：5’GGTCTTTACGGATGTCAACGTC3’

　　1.2.5.2 cDNA第一链的合成

　　取总RNA 2 μg，以 Oligo(dT)18 Primer 为引物，组成总体积为20 μL的逆转录反应体系，42 ℃孵育60 min，70 ℃ 10 min终止反应;将cDNA产物于-20 ℃保存。

　　1.2.5.3 PCR反应

　　PCR反应扩增目标cDNA：参照2×Taq PCR Master Mix(北京天为时代科技有限公司)试剂盒说明，加入25 μL PCR反应体系(cDNA模板2 μL，20 mmol/L PrimerⅠ上游引物1 μL，20 mmol/L PrimerⅡ下游引物1 μL，2×Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL)。βactin的反应参数：94 ℃ 5 min→94 ℃ 30 s→54 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，30个循环，最终延伸72 ℃ 7 min;GPR401反应参数：94 ℃ 5 min→94 ℃ 30 s→58 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，30个循环，最终延伸72 ℃ 7 min;GPR402反应参数94 ℃ 5 min→94 ℃ 30 s→58 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，30个循环，最终延伸72 ℃ 7 min;产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，用凝胶成像系统对DNA条带进行光密度扫描，以目的基因/βactin的比值表示相对表达水平。

　　1.3 统计学处理

　　数据均以x±s表示，采用SPSS 11.5软件分析，采用oneway ANOVA方法行统计学分析。P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度FFA孵育12 h对细胞GPR40 mRNA表达的影响

　　对照组以及0.25，0.5，1 mmol/L FFA组βTC3细胞孵育12 h后，RTPCR结果经统计学分析后显示，各组间βTC3细胞GPR40 mRNA的表达无明显改变(图1，表1)。

　　2.2 不同浓度FFA孵育24 h对细胞GPR40 mRNA表达的影响

　　各组βTC3细胞孵育24 h后，RTPCR结果经统计学分析后显示，与对照组比较，0.25 mmol/L FFA组GPR40的表达差别无统计学意义;0.5和1 mmol/L FFA组GPR40 mRNA的表达水平下降(P<0.05);与0.25 mmol/L FFA组比较，0.5和1 mmol/L FFA组GPR40 mRNA的表达水平也下降，差别具有统计学意义(P<0.05，图2，表1)。表1 FFA对βTC3细胞GPR40表达的影响(略)

　　E1、F1、G1、H1：1、0.5、0.25 mmol/L FFA组、对照组内对照βactin;E、F、G、H：1、0.5、0.25 mmol/L FFA组、对照组GPR40;Marker从上到下依次是1 031、900、800、700、500、400、300、200、100 bp.

　　2.3 Piog对长期FFA作用下βTC3细胞GPR40表达的干预作用

　　分别用含0.1，1，10 μmol/L的Piog以及不含Piog的DMEM培养液预先孵育细胞6 h后，加入FFA(终浓度为1 mmol/L)共同孵育24 h，RTPCR结果经统计学分析后显示，0.1 μmol/L Piog+1 mmol/L FFA组和1 mmol/L FFA组比较，βTC3细胞GPR40表达无统计学差异;但与1 mmol/L FFA组比较，1 μmol/L+1 mmol/L FFA组和10 μmol/L Piog+1 mmol/L FFA组细胞GPR40的表达差别均有统计学意义(P<0.01)，GPR40的表达随着Piog的升高而呈增加的趋势(图3,表2)。表2 Pigo对FFA作用下βTC3细胞GPR40表达的影响(略)

　　3 讨 论

　　脂肪酸与β细胞之间的交互作用是胰岛素分泌的正常调节要素， GPR40是近年来新发现的FFA的特异性受体，在生理状态下，正常的FFA水平刺激胰岛β细胞分泌胰岛素的作用部分是通过GPR40实现的[4]。中、长链FFA通过特异性地活化GPR40而激活各种细胞内信号传导通路，促进胰岛β细胞胰岛素分泌[5]。然而文献显示，FFA长期作用能够损害胰岛素分泌功能[12]。

　　βTC3细胞源自转基因小鼠的胰岛素瘤细胞，具有合成和分泌胰岛素的功能[7]。本研究以小鼠βTC3细胞为研究对象，观察了βTC3细胞在不同浓度的FFA孵育不同时间后GPR40的表达的变化。本实验研究结果发现，长期高浓度FFA作用能够影响胰岛βTC3细胞GPR40的表达;随着FFA孵育时间的延长，FFA组βTC3细胞中的GPR40 mRNA的表达水平与对照组比较明显降低。表明长期高浓度的FFA作用将对βTC3细胞造成损害，抑制βTC3细胞GPR40的表达。笔者认为，这可能是病理状态下FFA抑制胰岛素分泌的机制之一，引起这种现象的机制有待进一步研究。

　　2型糖尿病的发生多与胰岛素抵抗基础上的胰岛素相对缺乏(β细胞功能受损)有关[8]。因此治疗糖尿病如能针对胰岛β细胞功能受损进行干预，则有望改变糖尿病的疾病进程。文献显示，在正常人的胰腺β细胞中PPARγ mRNA水平和蛋白水平均呈现高度表达[5]，可能有助于保护胰岛β细胞功能。为了寻求避免FFA异常导致的GPR40表达受损的干预措施，笔者应用近年来广泛使用于临床的噻唑烷二酮类(TZDs)抗糖尿病药物Piog干预βTC3细胞，观察了Piog对FFA作用下βTC3细胞GPR40表达水平的影响。

　　笔者发现，预先用Piog孵育胰岛βTC3细胞，FFA作用下GPR40表达的降低将得到的有效遏止，提示Piog对于FFA作用下的βTC3细胞GPR40表达的减少具有一定的保护作用。推断Piog保护胰岛素分泌的功能可能在一定程度上通过保护GPR40的表达这一机制实现。这可能是TZDs逆转FFA作用下胰岛β功能异常从而抗糖尿病的机制之一。

　　糖尿病的发病机制迄今尚未阐明，脂毒性与胰岛β细胞功能衰退的关系以及PPARγ在保护胰岛β细胞功能、进而预防与治疗糖尿病中所起的作用仍在探讨中，继续这方面的研究将有助于进一步揭示糖尿病的病理生理机制，并为临床防治工作提供有益的参考和新的思路。

　　(致谢：福建医科大学分子生物学教研室林旭教授为实验的完成提供了大量帮助，在此致以衷心的感谢。)

　　【参考文献】

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