辛伐他丁对2型糖尿病大鼠血管内皮VCAM1和MCP1mRNA和
发表时间：2010-08-20 浏览次数：488次
作者：胡桂芳，武革 作者单位：广东医学院附属医院 1.危重病监护室;2内分泌科，广东湛江 524001基金项目：广东省卫生厅医学科研资助课题[编号：A2004469(2004)]
【摘要】 目的 了解辛伐他丁对2型糖尿病大鼠血管内皮细胞黏附分子1(VCAM1)和单核细胞趋化因子1(MCP1)的影响。方法 30只SD大鼠随机分为正常组(NC)、糖尿病组(DMC)、辛伐他丁治疗组(DMT)，每组各10只大鼠。喂养12周后抽血测定血脂全套，取主动脉标本以免疫组化和半定量RTPCR法分别检测VCAM1和MCP1的mRNA和蛋白表达。结果 DMT组大鼠血管内皮VCAM1和MCP1的mRNA和蛋白表达明显降低，与DMC组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 辛伐他丁可减少糖尿病大鼠血管内皮VCAM1和MCP1的表达，减轻血管内皮局部的炎症反应。
【关键词】 辛伐他丁 VCAM1 MCP1 糖尿病
Effect of simvastatin on endothelial expression of VCAM1 and MCP1 in rat model of type 2 diabetes mellitus
HU Guifang, WU Ge
1. Intensive Care Unit, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China
Abstract：Objective To investigate the effect of simvastatin on endothelial expression of vascular cell adhesion molecule1 (VCAM1) and monocyte chemoattractant protein1 (MCP1) in rats with type 2 diabetes mellitus. Methods Thirty SD rats were evenly randomized to normal group, diabetic group and simvastatin group. Serum levels of total cholesterol (TC), high density lipoprotein cholesterol (HDLC), low density lipoprotein cholesterol (LDLC) and triglyceride (TG) were assayed, and the aortic expression of VCAM1 and MCP1 was detected by immunohistochemistry and RTPCR in 3 groups after 12 weeks. Results The expression of VCAM1 and MCP1 protein and mRNA in aortic endothelium was significantly lower in simvastatin group than that in diabetic group (P<0.05). Conclusion Simvastatin could attenuate the endothelial inflammation by downregulation of VCAM1 and MCP1 expression in diabetic rat model.
Key words：simvastatin; VCAM1; MCP1; diabetes mellitus
近年来一系列前瞻性临床试验已证实他汀类药物除了有很好的降酯作用外，还可减少炎症细胞的浸润并延缓动脉粥样硬化的进程，稳定动脉腔内硬化斑块，减少冠心病的发生率和病死率，并有可能使动脉粥样硬化斑块逆转，其机制正在进行研究中[1]。糖尿病是冠心病的等危症，为了更好地阐明他汀类降酯药物抗动脉粥样硬化的作用机理，本文在国内首次对糖尿病大鼠应用辛伐他丁治疗，观察大鼠血管内皮VCAM1和MCP1的表达水平，了解辛伐他丁对糖尿病大鼠血管内皮的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
30只SD大鼠，由广东医学院实验动物中心提供，动物级别：2级，月龄：8周，雄性，体重200～250g。
1.2 方法
1.2.1 主要药物和试剂
辛伐他丁片剂为默沙东公司产品(规格：20 mg/片);链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司; VCAM1和MCP1多克隆抗体购自美国Santa cruz公司;血脂试剂盒、免疫组化SP法试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中山试剂公司;Trizol reagent、RTPCR试剂盒购自美国Invitrogin公司、VCAM1和MCP1引物合成于上海生物工程公司等。
1.2.2 动物模型的建立与分组
30只大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组(NC)、糖尿病组(DMC)、辛伐他丁治疗组(DMT)，每组10只大鼠。NC组以普通饲料喂养，DMC和DMT组喂以高脂饲料(20%猪油、3%胆固醇、0.5%胆酸钠、76.5%基础饲料),喂养第4周后禁食12 h，以STZ25 mg/kg单次腹腔注射，72h后取尾静脉血，以两次随机血糖≥16.65 mmol/L确立2型糖尿病模型大鼠制作成功。DMT组给予辛伐他丁2 mg/(kg·d)灌胃。NC组与DMC组分别给予蒸馏水6 mL/(kg·d)灌胃。于12周末禁食12 h后麻醉上述3组大鼠，心脏取血分离血清测空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDLCh)、高密度脂蛋白(HDLCh)。大鼠处死后迅速取出主动脉，留取主动脉弓处组织一段置于体积分数为10%的福尔马林固定液中，以待作免疫组化检查，剩余部分置于-180 ℃液氮中以提取RNA。
1.2.3 生化指标的检测
血糖采用葡萄糖氧化酶法，TC、TG、LDLCh 、HDLCh采用酶法。
1.2.4 免疫组化SP法检测
按说明书步骤操作：脱腊、漂洗、抗原修复、消除内源性活氧化物酶，滴加封闭液，弃封闭液分别加抗MCP1抗体和VCAM1抗体(羊抗大鼠多克隆抗体)，再加生物素标记的第二抗体与链亲和素-过氧化物酶溶液漂洗，DAB液染色，苏木素复染，用已知阳性结果做阳性对照，以PBS替代一抗做阴性对照。采用双人双目光学显微镜下分别观察大鼠主动脉内皮MCP1和VCAM1蛋白染色情况，表达强度依照阳性产物着色深浅分为4级：“-” 背景同空白对照;“+”为浅染的棕黄色(DAB染色)，无明显颗粒;“”为较深的棕黄色，可见明显颗粒;“”为深棕黄色并且有浓染颗粒。
1.2.5 半定量RT
PCR法检测血管组织MCP1和VCAM1的mRNA表达
取新鲜血管组织100 mg加入1 mL Trizol充分匀浆及吹打混匀提取总RNA。经752型紫外分光光度计测定260、280 nm吸光度。若A260/A280>1.8，计算其含量。逆转录为cDNA，以此为模板进行PCR扩增，MCP1上游引物：5’TGTTGTTCACAGTT GCTGCCTG3’,下游引物：5’GTGCTGAAGTCCTTAGGGTTGATG3’,产物长度为312bp。VCAM1上游引物：5 ’GGCTACATCCACTGACGCTGAG3’，下游引物：5’CCCTTCAGTAGTTCAATCTCCAGATGG3’，产物长度为240bp。内参GAPDH上游引物：5 ’ACCACAGTCCATGCCATCAC3 ’，下游引物：5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’，产物长度为452 bp。扩增条件：MCP1 94℃变性3min，94 ℃ 45 s，59.0 ℃ 45s，72 ℃ 1min, 扩增32个循环，72 ℃延伸10min;VCAM194℃变性3 min，94 ℃ 45 s，64 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min, 扩增35个循环，72 ℃延伸10 min。分别取PCR产物4 μL加1 μL6×上样缓冲液，经2%琼脂糖凝胶电泳，0.5 g/L溴乙锭染色20 min，凝胶在UVP 凝胶成像系统中扫描，并分析电泳带灰度。分别以特异性MCP1和VCAM1的扩增带灰度与相应内参GAPDH扩增带灰度之比，表示MCP1和VCAM1表达量。
1.3 统计学处理
应用SAS10.0统计软件作数据处理分析。计数资料采用卡方检验及卡方分割法。计量资料先进行方差分析，方差齐性者用单因素方差分析及q检验，方差不齐者采用H检验。有序分类资料采用秩和检验。
2 结果
2.1 各组大鼠空腹血糖、血脂的比较
经过8周的治疗后，DMT组血清TC、LDLCh低于DMC组，差异有统计学意义(P<0.01)，DMT组和DMC组的FPG、血清TG、HDLCh水平差异无统计学意义。详见表1。表1 各组大鼠空腹血糖、血脂的比较 (略)
2.2 辛伐他丁对糖尿病大鼠血管组织MCP1和VCAM1蛋白表达的影响(表2、3)表2 各组大鼠血管组织MCP1蛋白表达的比较(略)表3 各组大鼠血管组织VCAM1蛋白表达的比较(略)
NC组大鼠主动脉血管内皮无MCP1蛋白表达，少许VCAM1蛋白表达,血管细胞细胞核呈深蓝色，胞浆颜色浅淡，内皮细胞扁平，紧贴于平直的内弹力板上，中弹力板与平滑肌细胞整齐相间平行排列。DMT组大鼠见内皮细胞靠近血管腔内层有浅染的棕黄色的MCP1和VCAM1蛋白，内弹力膜较完整，中弹力板与平滑肌细胞细胞排列相间平行。DMC组大鼠内皮细胞呈较深棕黄色的MCP1和VCAM1蛋白，见浓染颗粒，内弹力膜消失或残存，平滑肌细胞排列紊乱，各层均有不同程度的VCAM1表达的棕黄色染色。MCP1见图1a～c;VCAM1见图2a～c。
2.3 辛伐他丁对糖尿病大鼠血管组织MCP1和VCAM1mRNA表达的影响
各组血管组织经RTPCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示，在200～300bp、300～400bp及400～500bp之间出现的条带分别与VCAM1基因片段(240bp)、MCP1基因片段(312bp)、GAPDH基因片段(452bp)的大小相符。NC组血管组织中没有出现MCP1条带，出现VCAM1条带。DMT组中MCP1及VCAM1mRNA表达受到抑制，低于DMC组，但仍高于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)(见表4，图3、4)。表4 各组大鼠MCP1和VCAM1 mRNA表达的比较(略)
3 讨论
糖尿病是冠心病的等危症，2型糖尿病并存的代谢综合症的各种危险因素都是冠心病的危险因素。炎症参与胰岛素抵抗(IR)、2型糖尿病及大血管并发症的发生发展。研究显示，内皮功能异常及内皮细胞的激活是糖尿病大血管病变的早期表现[2]。在高血糖、血脂异常、高胰岛素血症等影响下，各种黏附分子及趋化因子的表达增加，募集炎症细胞向动脉内膜迁移，始动及加速动脉粥样硬化的形成。这一过程涉及到许多细胞因子，如ICAM1、VCAM1、MCP1及E选择素等。本文结果亦显示，糖尿病大鼠大血管中VCAM1和MCP1的蛋白和mRNA表达均显著增高，证实了炎症反应存在于糖尿病大鼠大血管早期病变。
血脂异常是动脉粥样硬化和冠心病最重要的危险因素。2型糖尿病脂代谢紊乱的特点是血甘油三脂和低密度脂蛋白增高，高密度脂蛋白降低的三联症。积极的降脂治疗能明显降低冠心病的发生率和病死率。他汀类降脂药为HMGCoA还原酶抑制物，是降低LDLC和TC的一线药物。在广泛用于降低血脂的同时，研究显示他汀类降脂药可以改善内皮功能，具有抗炎作用。Nachtigal等[3]对动脉粥样硬化新西兰大鼠给予辛伐他汀治疗2周后，血管内皮功能明显改善，动脉粥样硬化形成早期内皮细胞P选择素、ICAM1、NOS的表达降低。庞文跃等[4]在体外实验中发现，阿托伐他汀抑制ICAM1的表达，明显改善动脉粥样硬化的内皮功能，具有抗炎及抗动脉粥样硬化作用。本文结果显示，糖尿病动物模型中辛伐他汀治疗后血清TC、LDLC水平下降，表明辛伐他汀对2型糖尿病大鼠有良好的降脂作用。免疫组化病理组织学观察到DMT组大鼠血管内膜厚度减轻，内弹力膜基本完整，平滑肌细胞排列无明显紊乱，表2、3中VCAM1及MCP1的蛋白表达阳性例数比较，DMT组与DMC组差异有统计学意义。同时，RTPCR结果显示DMT组大鼠血管中VCAM1及MCP1的mRNA表达低于DMC组大鼠，差异有统计学意义。本文结果提示辛伐他汀对糖尿病大鼠血管内皮细胞有保护作用，可减轻局部的炎症反应，延缓动脉粥样硬化的进程。其作用机理尚不十分清楚，可能主要通过调节血脂而产生，但近年来有研究证实他汀类降脂作用之外的抗炎作用、免疫调节等作用[5]。随着对他汀类药物更深一步的研究，其抗炎作用的多重机制机理必将会被人们认识。
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