RAGE及其剪接变体与糖尿病血管并发症

　　作者： 任晓妹，孙子林　(东南大学附属中大医院内分泌科，江苏南京 210009)

　　[摘要] 糖尿病血管病变是一种多因素疾病。糖基化终产物(AGE)与其受体(RAGE)相互作用在糖尿病血管病变的发展中起重要作用。RAGE转基因的糖尿病小鼠其肾脏病变更严重，应用AGE阻滞剂可阻断并发症的发生。目前已经发现了可诱导RAGE基因表达的细胞外信号及核因子，这些因素也被认为是糖尿病并发症的危险因素。通过分析RAGE多聚核糖体mRNA发现了3种主要的剪接变体:截去C端型、截去N端型和已知的全长型。人们把前者即可溶型RAGE命名为内源分泌型RAGE(esRAGE)，esRAGE可捕获AGE配体，中和AGE对内皮细胞的损伤活性，提示其有潜在的保护糖尿病性血管损伤的作用。

　　[关键词] 糖基化终产物;糖基化终产物受体;剪接变体;内源分泌型糖基化终产物受体;糖尿病血管病变

　　研究显示糖基化终产物(advanced glycation end products，AGE)的形成是导致糖尿病血管病变的主要环境因素，而糖基化终产物受体(receptor for advanced gly-cation end products，RAGE)表达异常是主要的遗传因素。目前已经发现了可诱导RAGE基因表达的细胞外

　　信号及核因子，这些因素也被认为是糖尿病并发症的 危险因素。迄今为止发现了3种RAGE剪接变体。内源分泌型RAGE(esRAGE)是RAGE的胞外可溶部分，其缺失胞内段和跨膜区域，体内实验发现，esRAGE能与AGE结合阻断细胞表面受体活性，中和AGE对内皮细胞的损伤活性。RAGE及其剪接变体成为研究糖尿病血管并发症的热点，阻断AGE.RAGE通路可为防治上述疾病提供新的靶点。

　　1 AGE与RAGE

　　AGE是还原糖如葡萄糖等与蛋白质、脂质及核酸上的游离氨基发生非酶促反应形成的Schiff碱和Ama-dori产物经过一系列的分子重排产生的不可逆聚合物，它具有棕色变、自发荧光和广泛交联等特征，可通过改变被修饰蛋白的结构和功能或与特异的RAGE结合影响胞内信号转导、刺激细胞因子等释放而发挥致病效应。AGE受体包括RAGE、巨噬细胞清道夫受体Ⅰ和Ⅱ、寡糖转移酶.48(OST.48，AGE.R1)、80K.H磷蛋白(AGE.R2)及半乳糖结合蛋白(galectin.3，也称AGE.R3)。目前认为AGE.RAGE通路导致血管稳态功能失调，并在糖尿病血管病变的发展中起重要作用。RAGE属于细胞表面分子免疫球蛋白超家族成员，广泛存在于体内多种细胞表面，作为一种细胞信号转导受体与多种配体结合诱导细胞功能紊乱，参与糖尿病并发症、阿尔茨海默病、炎症及肿瘤等病理过程。近年的研究发现除了葡萄糖衍生AGE能与RAGE结合，甘油醛糖衍生AGE及乙醇醛衍生AGE也能与RAGE结合[1] 。内源性RAGE配体有AGE、EN.RAGE.S100(S100.钙粒蛋白家族成员之一)、双性素、β样淀粉肽和转甲状腺素蛋白等。

　　2 RAGE的结构

　　人RAGE基因位于第6号染色体短臂，含有11个外显子和1个长约1.7kb的5′.侧域。氨基酸序列分析表明，RAGE由400多个氨基酸组成，分为3个区域，其胞外部分包含3个免疫球蛋白样区域(1个V区和2个C区)，位于氨基端的V型区是与AGE结合的主要部位，其后是疏水的跨膜信号区域，最后部分为胞内段。胞内段与B细胞活化信号CD20高度同源，其基本结构对信号转导至关重要，不同的物种包括人、牛、大鼠及小鼠高度保守，通过分析氨基酸序列将其分为3个部分:基础氨基酸相对丰富的近膜端17氨基酸区域、富含谷氨酸的中心17氨基酸区域和含有9个残基的低度保守C端。Ishihara等报道RAGE C段胞质内区域的近膜段是RAGE与胞外信号调节激酶(extracel-lular signal-kinase，ERK)结合的必须部分[2] 。

　　3 RAGE的基因调节

　　RAGE基因表达上调可激发糖尿病血管病变， Yamamoto等[3] 培育的RAGE转基因糖尿病小鼠血管细 胞过度表达RAGE，表现出更严重的肾病及视网膜病变，抑制其体内AGE的产生可阻止并发症的发生，所以RAGE基因调节机制尤为重要。目前已经发现了可诱导RAGE基因表达的细胞外信号及核因子，包括IL.6、血管内皮细胞生长因子、内皮细胞中的血管细胞粘附分子、巨噬细胞.克隆刺激因子、巨噬细胞组织因子和神经细胞中的Bc1.2，这些因素也被认为是糖尿病并发症的危险因素[2] 。Tanaka等[4] 分离出3种RAGE基因转录引物:AGE本身、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和17β.雌二醇。AGE和TNF.α与RAGE结合部位相同，位于RAGE5′.侧域序列第671核苷酸，而17β.雌二醇结合部位位于第189和172核苷酸。电泳分析发现核转录因子NF.κB是RAGE与AGE及TNF.α结合的转录因子，Sp.1.雌激素受体α复合体是RAGE与雌二醇发生反应的因子[3] 。众所周知，TNF.α可导致胰岛素抵抗，而RAGE基因的作用揭开了TNF.α的另一方面作用:糖尿病患者体内TNF.α水平增高可通过RAGE加速糖尿病并发症进展。AGE本身可活化RAGE基因，并提高RAGE免疫源性而加重血管损伤。这一发现与以前观察到的结果一致:富含AGE的血管表现为RAGE免疫反应性增加[5] 。这种正反馈环能加重糖尿病的血管损伤[4] ，而雌二醇诱导的RAGE活化使妊娠糖尿病并发症加重[2] 。

　　4 esRAGE

　　选择性剪接拼接是基因功能放大、调节的一种重要手段。遗传研究表明40%～60%人类基因外显子和内含子存在剪接拼接，继而影响基因的调节结果[6] 。在RAGE，选择剪接的esRAGE产物可与位于细胞膜上的全长型RAGE竞争性地同AGE结合。esRAGE即RAGE胞外段，为锲状可溶片段(V.C.C′)，存在于正常个体，半衰期约22h，体内实验发现esRAGE能与AGE结合，并阻断细胞表面受体活化。Malherbe等[7] 最先在人胚胎肺组织中发现了人esRAGE，该剪接变体在第3外显子3′段拼接部位切除内含子2，导致42核苷酸缺失，5′段拼接部位切除第7内含子，第7外显子29核苷酸延伸，外显子8移位。此后Park等6报道在人大脑星型胶质细胞和外周血单个核细胞中存在一个新的RAGE mRNA剪接变体△8 .RAGE，△ 8 .RAGE缺少第8外显子，因为框架移位在第10外显子形成一个早期终止密码子。短暂转染实验证实△8 .RAGE mRNA编码分泌型蛋白esRAGE。Yonekura等[8] 通过分析血管内皮细胞及周围细胞多聚核糖体的ploy(A) + RNA，也发现了一个新的围编码可溶性RAGE蛋白的剪接变体，该剪接变体包含第9内含子5′部分，缺少第10外显子，在内含子5′部分因为框架移位形成早期终止密码子。说明esRAGE可由不同的细胞和组织分泌合成。进一步研究发现了3种主要的RAGE剪接变体 [9] :已知的全长膜结合型、截去N端膜结合型和截去C端可溶型。全长膜结合型含有完整的胞外段、跨 膜区域和胞内段，截去N端膜结合型含有跨膜区域和 胞内段，缺失胞外段V区，截去C端可溶型为RAGE胞外段，缺少跨膜区域和胞内段(图1)。不同的细胞RAGE剪接变体表达比例不同，在内皮细胞截去C端型>全长型=截去N端型，而周围细胞中全长型>截去N端型>截去C端型 [9] 。全长膜结合型和截去C端膜可溶型能结合AGE，而截去N端膜结合型不能与AGE结合，进一步说明RAGE与配体结合的部位位于氨基端类似V区区域。

　　图1 RAGE剪接变体的拓扑结构 5 RAGE及其剪接变体与糖尿病血管并发症作为RAGE的主要配体AGE，羧甲基赖氨酸复合物(carboxymethyl-lysine adducts，CML)在受体缺失状态下表现出生物惰性，既不发出荧光，也不产生氧化物或发生交联[5] 。RAGE另一配体β样淀粉肽也表现出类似的惰性[5] 。配体与细胞表面RAGE结合后，激活RAGE并作为信号转导受体激活细胞内各种信号转导机制，导致细胞功能紊乱。许多实验表明P21 RAS 、P 38 丝裂原活化蛋白激酶、Cdc42.rac、转录因子NF.κB和氧自由基等构成了RAGE介导的信号转导途径 [10] 。NF.κB是多种“损伤反应基因”的多效转录调节因子，调控内皮激素.1、细胞粘附分子.1及组织因子等的基因转录。它的激活可引起靶细胞中损伤反应基因的表达，诱导产生多种损伤因子，产生致病效应。激活的NF.κB又可作用于RAGE基因启动子增强RAGE基因表达。另外AGE与RAGE结合后可诱导发生氧化应激，产生自由基导致氧化损伤、血管收缩和促凝血状态，促进糖尿病血管并发症如动脉粥样硬化、肾脏病变、视网膜病变 等的发生发展。Yamamoto等[3] 培育出转基因小鼠，其 血管内皮细胞高度表达RAGE，与另一刚出生不久的糖尿病小鼠杂交，其后代基因型可表现为DM + RAGETg + 、DM + RAGETg - 、DM- RAGETg + 和DM- RAGETg - 。前两组表现为高血糖和高HbA1C，非CML AGE水平迅速上升，但两者之间并无显著差异。这与对糖尿病及非糖尿病患者所观察到的结果一致。同DM + RAGETg - 小鼠相比，DM + RAGETg + 小鼠肾体积增大、系膜增生、肾小球硬化、蛋白尿增加及血肌酐水平升高。使用AGE抑制剂OPB.9195，则增高的血肌酐水平和肾小球硬化被彻底阻断，血糖和HbA 1 C水平不受影响。因此阻断AGE.RAGE系统、抑制RAGE活化有可能成为治疗糖尿病肾病的新靶点。由此可见，RAGE对糖尿病血管并发症的发生、发展有重要作用。

　　esRAGE可中和AGE诱导的胞内反应，运用表面胞质基因组共振测定证实esRAGE可与AGE结合，此外AGE可诱导血管内皮细胞生长因子[9] 。运用特异性es-RAGE抗体检测发现，正常人体内存在esRAGE [9] 。Yamamoto和Park等 [3，11] 的研究均证实，esRAGE可改善糖尿病大鼠肾病及动脉粥样硬化。大量的体外实验也证实，esRAGE可阻断由RAGE介导的AGE引起的血管通透性增加及氧化应激反应。esRAGE可捕获RAGE配体，中和AGE对内皮细胞的损伤活性，提示其有潜在的保护糖尿病血管免受损伤的作用。各种各样的RAGE剪接变体可能存在于许多组织，其代谢产物有可能影响到RAGE介导的发病机制和免疫调节。应用ELISA法检测血清esRAGE水平有助于对RAGE介导的疾病并发症的筛查[1] 。

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