PI3K、P70S6K在胰岛素抵抗大鼠脂肪中的表达及其意义

　　作者：王艳军 尤雪娜 赵丹 姜苒华 刘国良 作者单位：中国医科大学附属盛京医院内分泌科，辽宁 沈阳 110004 辽阳糖尿病医院 中国医科大学第一临床学院内分泌科

　　【摘要】 目的 测定不同饮食喂养大鼠产生胰岛素抵抗(IR)的情况，观察大鼠脂肪中PI3K、P70S6K的表达及大鼠血清中游离脂肪酸(FFA)和超敏C反应蛋白(hs-CRP)的变化。方法 4周龄Wistar雄性大鼠40只，随机分为4组，分别以普通、高糖、高脂、高糖高脂饲料喂养大鼠8 w后，行高胰岛素-正常血糖钳实验，对大鼠IR程度进行评估，应用酶联免疫吸附法检测大鼠血清中FFA及hs-CRP，分别用原位杂交、Western印迹方法检测大鼠脂肪中的PI3K、P70S6K。结果 高脂、高糖高脂饲料组大鼠产生IR，普通、高糖饲料组未出现IR，IR组大鼠FFA及hs-CRP明显高于非IR大鼠(P<0.01)，PI3K表达在IR组大鼠明显低于非IR组大鼠、P70S6K的表达在IR组大鼠明显高于非IR组大鼠(P<0.01)。结论 高脂、高糖高脂饲料喂养大鼠8 w可成功诱导大鼠产生IR，IR的产生可能与肥胖、高FFA及炎症反应有关，PI3K在IR组表达降低，P70S6K升高。

　　【关键词】 胰岛素抵抗(IR);游离脂肪酸(FFA);超敏C反应蛋白(hs-CRP);PI3K;P70S6K

　　基金项目：辽宁省教育厅资助课题(No.2004D166)

　　The expression and significance of PI3K and P70S6K in insulin-resistant rat fat

　　WANG Yan-Jun，JIANG Ran-Hua，LIU Guo-Liang,et al.

　　Endocrine Department of Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University，Shenyang 110004，Liaoning，China

　　【Abstract】 Objective To determine insulin resistance (IR) of individually fed rats，by detecting the expression of PI3K，P70S6K in fat and the changes of free fatty acid (FFA) and high sensitive CRP(hs-CRP) in serum.Methods Forty Wistar male rats aged four-week were randomly divided into four groups，hyperinsulinemic euglycemic clamping experiment was used to evaluate IR of rats fed respectively by general,fatty，hyperglycemic and fatty-hyperglycemic food for 8 w.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine serum FFA and hs-CRP，hybridization in situ and Western blot were used to detect PI3K and P70S6K in fats.Results IR was found in rats fed with fatty and fatty-hyperglycemic food，but not in that fed with general and hyperglycemic food.FFA and hs-CRP levels in IR group were clearly higher than those in non-IR group (P<0.01).PI3K in IR group was distinctly lower than that in non-IR group,but P70S6K behaved contrarily(P<0.01).Conclusions IR can be successfully induced with 8 weeks fatty or fatty-hyperglycemic feeding.The appearance of IR is possibly related with obesity,high FFA level and inflammation.In IR group,the expression of PI3K decreases，but that of P70S6K increases.

　　【Key words】 Insulin-resistance;Free fatty acid (FFA);High sensitive C reactive protein (hs-CRP);PI3K;P70S6K

　　胰岛素抵抗(IR)是糖尿病(DM)、肥胖、高血压与动脉硬化等疾病共同的危险因素与病理生理基础。IR的研究常涉及肝脏、骨骼肌、脂肪等胰岛素(INS)靶组织。目前许多研究是关于INS受体和受体后信号传导系统，尤其是INS信号链传导障碍在IR中的作用日益受到关注。PI3K、P70S6K均为INS信号传导通路中的调节因子。PI3K是处于INS受体底物(insulin receptor substrate，IRS)后的信号分子，是INS信号向调节糖代谢方面传递的关键蛋白。P70S6K为核糖体40 S小亚基蛋白S6的激酶，是细胞生长、增殖的关键性因子，主要促进蛋白质翻译，受PI3K以及哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)信号途径的调节〔1〕。本研究通过检测IR脂肪组织磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、P70S6K的表达，探讨其在IR发生中的作用及意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 Wistar雄性大鼠40只(中国医科大学实验动物中心提供)，4周龄，体重70～80 g，单笼饲养，室内温度保持在25℃左右，湿度50%左右。明暗周期12 h，自由饮水和进食。随机分为正常对照组、高糖组、高脂组及高糖高脂组各10只。

　　1.2 饲料配制 基础饲料为中国医科大学实验动物中心配制;基础饲料：总热量为：400 kCal/100 g;高脂饲料：75 g基础饲料+25 g猪油。高糖饲料：60 g基础饲料+40 g蔗糖;高糖高脂饲料：60 g基础饲料+15 g猪油+25 g蔗糖。

　　1.3 实验仪器和所用试剂 大鼠血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)酶联免疫吸附测定试剂盒，购自上海朗卡科技有限公司;大鼠游离脂肪酸(FFA)酶联免疫吸附铜染色试剂盒，购自南京建成生物工程研究所;大鼠血清INS酶联免疫吸附测定试剂盒，购自大连泛邦化工公司。PI3K：抗大鼠PI3K原位杂交试剂盒，购自武汉博士德公司。P70S6K：Western试剂，一抗为马抗小鼠Ig-G(美国Santa Cruz公司);山羊抗兔二抗购自美国Sigma公司;考马斯亮兰试剂盒购自南京建成生物研究所。

　　1.4 IR大鼠模型的建立及IR评估 各组饮食喂养大鼠8 w后，进行INS、FFA、hs-CRP的测定及高INS-正常血糖钳实验。经静脉输液泵恒定的注入速效INS(6.0 mU·kg-1·min-1)(诺和诺德公司)。每5 min经动脉采血10 μl测定血糖(葡萄糖氧化酶电极法，BIOSEN5030，德国产)，根据血糖值调整葡萄糖(20%)的输入速度，使血糖维持于空腹(FPG±0.5 mmol/L)的水平，如此过程经过120 min,后60 min的血糖值和葡萄糖的输入速度都进入稳定期，计算60～120 min的葡萄糖输注率(GIR)，作为受试个体的INS敏感性的指标。GIR(mg·kg-1·min-1)=稳定期葡萄糖的平均输入速度(ml/h)60(h换算为min)×20%(葡萄糖浓度)÷体重(kg)。

　　1.5 统计学方法 数据均用x±s表示，采用统计学软件SPSS 11.5进行单因素方差分析及组间t检验。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠体重、INS、FFA、hs-CRP、GIR的变化 各组大鼠体重增加最大的是高糖高脂组，依次为高脂组，高糖组，正常对照组体重增加最少。高糖高脂组与高脂组的血清INS的水平明显高于正常对照组和高糖组(P<0.01)，而正常对照组与高糖组之间、高糖高脂组与高脂组之间无统计学差异(P>0.05)。高糖高脂组与高脂组的血清FFA含量高于正常对照组与高糖组(P<0.05)，而正常对照组与高糖组之间、高糖高脂组与高脂组之间无统计学差异(P>0.05)。高糖高脂组与高脂组的血清hs-CRP含量高于正常对照组与高糖组(P<0.05)，高糖高脂组与高脂组之间，正常对照组与高糖组之间无统计学差异(P>0.05)。高糖高脂组与高脂组GIR水平明显低于正常对照组和高糖组(P<0.01)，而正常对照组与高糖组之间无统计学差异(P>0.05)。见表1。

　　2.2 各组PI3K的表达 正常对照组可见大量棕黄色颗粒，高糖组可见多数棕黄色颗粒，而高脂组和高脂高糖组未见棕黄色颗粒。见图1。

　　2.3 各组大鼠脂肪组织中P70S6K的表达 见图2。

　　表1 各组体重变化、INS、FFA、hs-CRP、GIR的变化(略)

　　与正常对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.05;与高糖组比较：3)P<0.01,4)P<0.05

　　图1 各组大鼠脂肪组织中PI3K表达(×400)(略)

　　图2 各组大鼠脂肪组织中P70S6K的表达(略)

　　3 讨论

　　研究发现高脂饮食可导致骨骼肌葡萄糖摄取减少〔2～4〕，可减少INS抑制肝糖输出的能力〔5〕并影响葡萄糖刺激胰岛细胞的INS分泌。其作用机制可涉及INS受体及INS受体后信号传导系统，如IRS蛋白表达量及磷酸化减少、葡萄糖运载体(GLUT)表达及转位异常、影响PI3K、蛋白激酶B(PKB)及非典型蛋白激酶C(aPKC)的活性改变等IR中的许多环节〔6〕。还涉及葡萄糖激酶(GK)及葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PHD)活性减弱、糖原及6磷酸葡萄糖(G6P)含量改变等细胞内糖代谢的多个方面〔7〕。

　　INS和INS类似物(L-783，281)均可通过激活IRS-1/PI3K途径使β细胞内钙离子浓度升高，刺激INS分泌〔8，9〕，还可通过PI3K下游P70S6K和PKB/AKT途径，分别促进INS和葡萄糖激酶基因转录和合成〔10〕形成β细胞INS自分泌正反馈调节。A型INS受体主要通过激活PI3K和下游P70S6K来调节INS基因转录;B型INS受体则通过PI3K及PKB/AKT途径调节β细胞葡萄糖激酶的基因转录，表明INS可以通过选择不同INS受体异构体发挥作用。IRS主要通过PI3K激活途径发挥作用，是β细胞INS分泌的重要信号。加入PI3K抑制剂可阻断IRS-1增加β细胞内Ca2+浓度，刺激INS分泌作用，表明，IRS-1主要通过PI3K激活途径发挥作用，是β细胞INS分泌的重要信号，并通过IRS-1和PI3K/AKT信号途径影响下游PHAS-1的活性，抑制β细胞复制，使INS基因转录减低〔11〕。

　　mTOR和P70S6K的激活引起IRS-1丝氨酸磷酸化，从而引起与IRS-1相关的PI3K活性降低，相反，经过转基因缺乏S6K1的大鼠表现出很强的抵抗年龄和饮食诱导肥胖所致的IR〔12〕。P70S6K是这些信号途径的共同下游，在INS信号系统中，处于下游的一些丝(苏)氨酸激酶，如mTORs，P70S6K激酶及数种aPKCs可使IRS-1上的丝氨酸磷酸化，从而对INS信号转导起负性反馈调节作用，长期作用机制可能为使IRS-蛋白与IR解离，或对受体酪氨酸激酶起抑制作用，或是使IRS-1不能保持于紧靠IR的位置〔13〕。

　　本研究结果表明，在IR大鼠中INS的靶器官脂肪组织中PI3K的表达均明显减少或消失，P70S6K的表达明显增加，并且以上指标与FFA、GIR有明显的相关性。FFA与IR大鼠的肝脏、肌肉、脂肪组织中的P70S6K有明显的正相关性，而GIR与IR大鼠的肝脏、肌肉、脂肪组织中的P70S6K有明显的负相关性，说明高糖高脂引起肥胖，IR可涉及到各个INS的靶器官。本实验中可见，PI3K在IR大鼠中的表达减少，与大鼠IR的程度也有关系，即：IR程度越重，PI3K的表达越少，也证明了PI3K在INS信号传导中起正性调节作用，而P70S6K则与PI3K相反，在INS信号传导中起负性调节作用。

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