二酯酰甘油

　　作者：徐静，易兰兰，张春虹，王俊宏，戴信刚，王利 (西安交通大学医学院第二附属医院内分泌科，陕西西安 710004)

　　摘要：目的 研究糖尿病大鼠肾小球中蛋白激酶C(PKC)的活性变化及转化生长因子β1(TGFβ1)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达情况，探讨3者之间的相互关系及其与糖尿病肾病(DN)发生、发展的相关性。方法 选用雄性SD大鼠，用链脲佐菌素制备大鼠糖尿病实验模型，随机分为正常对照组、糖尿病2周(DM2)组和糖尿病4周(DM4)组。大鼠断头处死，分离肾小球，提取纯化胞浆及胞膜蛋白。利用[r32P]ATP底物磷酸化的方法检测胞浆及胞膜PKC活性;用免疫组织化学法检测VEGF和TGFβ1在各组大鼠肾小球及肾小管中的表达。结果 ①DM2、DM4组肾小球细胞内总的PKC活性与对照组无显著性差异，胞浆PKC活性略有下降， 但相差不显著(P>0.05);DM2、DM4组肾小球细胞膜PKC活性均明显高于正常对照组(P<0.05)，且细胞膜PKC活性与肾脏肥大指数(肾重/体质量)和内生肌酐清除率(Ccr)呈正相关。②DM2、DM4组VEGF和TGFβ1的表达均高于正常对照组(P<0.01)。③肾小球细胞膜PKC活性与VEGF和TGFβ1的表达呈正相关。结论 高血糖慢性刺激可引起肾小球PKC活性增高，并上调TGFβ1和VEGF的表达，进一步导致肾小球滤过膜通透性和滤过率增加，这在糖尿病早期肾内血流动力学改变中发挥着重要的调控作用。

　　关键词：蛋白激酶C;糖尿病肾病;转化生长因子β1;血管内皮生长因子

　　The relationship between DAGPKC signal conducting system

　　and cellular factor and diabetic nephropathyXu Jing, Yi Lanlan, Zhang Chunhong, Wang Junhong, Dai Xingang, Wang Li

　　(Department of Endocrinology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective To explore the activation of protein kinase C(PKC) and the expression of transforming growth factor β1(TGFβ1) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in renal of diabetic rats at early stage, and to discuss the relationship of PKC, TGFβ1 and VEGF and their effects on diabetic nephropathy(DN). Methods Male SD rats were induced to diabetic rat model with streptozotocin. Rats were randomly divided into control group and two, four week diabetic group. After all group rats were killed, glomeruli were separated and membrane protein and cytosolic protein were picked up. The activity of PKC in renal glomeruli of each rat was detected by radioimmunoassay. The change of TGFβ1 and VEGF expression in renal tissue of each rat was observed by immunohistochemistry. Results ① Membrane PKC activity of glomeruli were significantly elevated in two, fourweek diabetic rats than that in control group(P<0.05). There were no significant differences in the cytosolic PKC concentration of glomeruli among three groups (P>0.05). Membrane PKC activity had positive relationship with raito of kidney/body weight and Ccr(P<0.01). ② The expression of TGFβ1 and VEGF in the renal tissue were significantly elevated in two, fourweek diabetic rats than that of control. ③ The activation of membrane PKC had positive relationship with expression of TGFβ1 and VEGF. Conclusion Hyperglycemia may lead to the activation of PKC, and the activation of PKC may lead to the expression of TGFβ1 and VEGF. They take important effect on the occurrence and development of DN.

　　KEY WORDS: diabetic nephropathy(DN); protein kinase C(PKC); transforming growth factor β1(TGFβ1); vascular endothelial growth factor(VEGF)

　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)作为糖尿病重要的微血管并发症之一，已成为慢性肾功能衰竭的主要原因。近年来研究发现，众多血管活性物质和细胞因子在DN的发生、发展中发挥重要作用,而二酯酰甘油(diacylglycerol, DAG)蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)信号传导通路的激活可能是这些物质的共同作用途径。有研究表明，PKC在DN时活性增高，但其在肾组织中的定位及其在DN发病过程中的动态变化，以及与其他一些与DN发病有关的细胞因子之间的关系研究尚少。本研究旨在探讨PKC、TGFβ1 、VEGF在DN发病过程中的作用及其相互关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 纯种雄性SD大鼠48只，体重236-312g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，血糖正常。随机分为3组：正常对照组(N组)、糖尿病2周(DM2)组和糖尿病4周(DM4)组，每组16只。动物模型的建立：糖尿病组大鼠腹腔注射链脲佐菌素65mg/kg(Sigma公司，溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液中，pH4.6);对照组只注射相同体积的柠檬酸缓冲液。72h后取尾静脉血测定血糖及尿糖，血糖≥16.7mmol/L、尿糖()-()确定为糖尿病大鼠。实验期间自由饮水、进食，室温18-28℃，相对湿度60%-80%。

　　1.2 标本的留取 实验2、4周末，先给大鼠称体重，留取段尿(2-3h)测定尿肌酐(Ucr)。股动脉取血，2000r/min离心10min，取上清液4mL，置-20℃冰箱待测血肌酐(Scr)。上述指标均由AV1000全自动生化分析仪检测。然后将大鼠断头处死，肾脏称重，一部分在4℃生理盐水中处理后用作放免(PKC)，另一部分肾组织用10%(体积分数)甲醛溶液固定后做普通病理(HE染色)和免疫组化染色(兔抗鼠TGFβ1多克隆抗体购于宝泰生物技术公司，兔抗鼠VEGF单克隆抗体购于中山生物技术公司)。

　　1.3 PKC活性测定及TGFβ1、VEGF免疫组化染色

　　1.3.1 肾小球分离 处死大鼠，取出肾脏，剥离肾包膜，剪下肾皮质并将其剪碎。将肾皮质在180μm网筛上研磨，用生理盐水反复冲洗，收集过筛悬液。再依次经过125μm和76μm筛网，进一步用生理盐水冲洗第3筛，再收集筛面上的肾小球。镜下检查肾小球纯度>95%，台盼蓝拒染法肾小球活力>90%。

　　1.3.2 肾小球PKC活性测定 按照Graven等的方法，制备肾小球胞浆及胞膜蛋白。 PKC试剂盒购于北京亚辉生物医学工程公司;IIIS型组蛋白、[γ32P]ATP及二酰基甘油均购于sigma公司。以ⅢS为底物， [γ32P]ATP为磷的供体，在30℃反应7min后，取反应液25μL置于强阳离子交换滤纸上(1cm×2cm)，将滤纸吹干，浸于75mmol/L磷酸溶液中终止反应。用75mmol/L磷酸溶液反复洗3次，每次2min，最后将滤纸烘干，置于含10mL蒸馏水的液闪瓶中，用Beckman液闪仪测定。通过30℃时每毫克蛋白质每分钟催化γ32P掺于底物蛋白的pmol数表示PKC活性。结果为3次检测的均值，单位:pmol/(min?mg)。

　　1.3.3 TGFβ1 免疫组化半定量分析 每张切片随机选取15个视野，在光密度和放大倍数一致的条件下，统计得到阳性染色面积占选定分析总场面积的比值，取其均值。

　　1.3.4 VEGF免疫组化染色 在400倍光镜下每例标本随机选取5个阳性表达的肾小球，测其肾小球阳性表达细胞率，求其均数。

　　1.4 统计学处理 结果以 ±s表示，应用SPSS 11.5软件进行统计处理。两组间比较用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析和q检验，相关分析采用单因素相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 各组体重、肾重、肾脏肥大指数、Ccr及血糖的变化 糖尿病组大鼠体重进行性下降，肾重却逐渐增加。 DM2、DM4组的肾肥大指数与对照组比较均有显著性差异(P<0.01)。 Ccr进行性增加，DM2、DM4组与对照组比较均有显著性差异(P<0.01)，而DM2和DM4组相比无统计学差异(P>0.05，表1)。表1 三组大鼠血糖、肾功能等指标的变化(略)

　　2.2 PKC活性变化 DM2、DM4组大鼠肾小球PKC总活性和胞浆PKC活性与对照组比较均无差异;胞膜PKC活性明显高于对照组(P<0.05)。DM4组大鼠的胞膜PKC百分比明显高于对照组(P<0.05)。 直线相关分析显示，细胞膜PKC活性与肾脏肥大指数及肌酐清除率呈显著正相关(r1=0.693，r2=0.819，P<0.01，表2)。表2 三组大鼠肾小球PKC活性的变化(略)

　　2.3 TGFβ1、VEGF的表达 TGFβ1可表达于正常大鼠和糖尿病大鼠肾小球内皮细胞、肾小管上皮细胞及肾脏系膜细胞浆之中。在糖尿病大鼠自成模后2周其表达开始增加，随病程延长而渐增加。DM2、DM4组TGF β1的表达均明显多于对照组(P<0.01)。相关分析表明，肾小球TGFβ1的表达与胞膜PKC活性及肌酐清除率均呈正相关(r1=0.629，r2=0.708，P<0.05，表3、图1)。表3 实验大鼠肾组织TGF β1的动态变化(面积比%)(略)图1 大鼠肾小球中TGFβ1免疫组化染色结果(略)

　　在正常肾组织中，VEGF主要在肾小球脏层上皮细胞及肾小管上皮细胞表达;而在糖尿病大鼠肾组织中，除在上述部位表达阳性外，在部分肾小球壁层上皮细胞、系膜细胞也表达。与对照组相比较，DM2、DM4组VEGF的表达增多(P<0.01)。VEGF与肾脏肥大指数、肌酐清除率及胞膜PKC活性呈正相关(r1=0.682，r2=0.774，r3=0.720，P<0.01，图2)。图2 大鼠肾小球中VEGF免疫组化染色结果(略)

　　3 讨 论

　　近年来，DAGPKC细胞内信号传导系统异常在糖尿病慢性并发症中的作用日益受到重视。PKC是一组密切相关的有多种亚型的蛋白质家族，广泛存在于各种组织细胞内。静息状态下PKC主要以无活性的形式存在于胞浆中;糖尿病状态下，由于持续性高血糖使细胞内葡萄糖流量增加，葡萄糖可通过糖酵解途径从头合成DAG。DAG为PKC的内源性激活剂，当细胞内DAG含量增加，可促使PKC移位至细胞膜而被激活。激活的PKC通过对多种膜蛋白的磷酸化发挥其活性作用，且广泛参与多种细胞信息传递、离子通道调节及细胞的增殖、分化、癌变等一系列与生命现象相关的过程。始动因子PKC的膜转移现象为PKC激活的重要标志。

　　Craven等首次报道糖尿病大鼠肾小球总PKC活性与对照组无显著差异，但细胞膜PKC活性增高了4倍而胞浆PKC活性则显著下降。随后研究高糖培养的肾小球系膜细胞(MC)时也有类似发现，并观察到DAG含量明显增高，提示高糖可引起肾小球细胞内PKC由胞浆到胞膜移位活化。至此，DAGPKC通路激活与DN的关系引起众多关注。

　　本实验结果表明糖尿病大鼠肾小球胞浆PKC活性轻度下降，但与对照组比较无明显差异(P>0.05)，而肾小球细胞膜的PKC活性显著增高，出现PKC由胞浆向胞膜的转移过程， 胞浆内PKC轻度下降即可引起胞膜PKC明显升高。这与文献报告一致。糖尿病大鼠病理表现为肾脏肥大、肾小球滤过率增高，这种糖尿病大鼠PKC的激活与肾小球高滤过现象同时出现，提示PKC作为细胞内重要的第二信使，可能在糖尿病早期肾脏病变中发挥着重要的调控作用。本实验同时观察到糖尿病大鼠肾脏组织细胞膜PKC活性随病程延长逐渐升高，病理变化有肾小球体积增大，且检测到胞膜PKC活性升高与肾脏肥大指数、肌酐清除率呈正相关关系，并与肾功能及组织学改变具有时间上的一致性。因此，PKC的激活可能参与了DN的发生。

　　在DN时，异常的葡萄糖代谢是导致TGFβ1升高的主要因素，糖尿病早期存在的血流动力学改变如高滤过、肾小球毛细血管跨膜压升高，是TGFβ1产生增加的重要因素;此外肾脏局部肾素血管紧张素系统(RAS)亢进使血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)产生过多也是引起高血糖状态下TGFβ1表达增加的另一重要因素。不仅是高糖，其糖化产物也可继续刺激TGFβ1的表达，造成肾脏损害。研究发现，糖尿病病人和实验动物的肾小球，以及高糖状态下培养的肾小球系膜细胞内TGFβ1增多，而TGFβ1能直接刺激细胞外基质(ECM)的过度表达，从而引起毛细血管基底膜增厚肾小球系膜增殖。这种现象可被PKC抑制剂所阻止，表明高糖可能通过PKC途径促使肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞上调TGFβ1的表达。本实验发现肾小球细胞膜PKC活性与肾小球及肾小管间质TGFβ1的表达呈正相关。这进一步说明高糖环境下PKC的活化可能促使了TGFβ1的高表达，从而参与了DN的发生。VEGF是一组分子质量为34-45ku的同源二聚体糖蛋白，它可以促进血管发生及形成，内皮细胞增殖、迁移，增强血管通透性。PKC的功能之一是促进VEGF的mRNA表达和肽链合成，从而引起血管通透性增高和血管生成，这是造成糖尿病肾脏病变的重要机制之一。研究发现，PKC激动剂佛波醇酯能加强肾脏内皮细胞对白蛋白及其他大分子物质的通透性，而PKC抑制剂则可改善高糖诱导的肾脏内皮细胞对白蛋白通透性的增高。据此推测，PKC活化使肾血管通透性加强的机制也与VEGF表达有关。本实验中发病鼠血糖已达到稳定的高水平状态，随着高血糖持续时间的延长，VEGF的表达有增加的趋势，而各不同病程的糖尿病鼠间血糖值比较差异无显著性。表明高血糖对于VEGF表达的影响突出体现在持续时间的长短上，而高血糖本身并不影响VEGF的表达，可能是高血糖间接通过DAGPKC传导系统而起的作用。本实验结果显示，正常大鼠肾小球内VEGF主要表达于脏层上皮细胞;而在DM大鼠，随着病程延长，VEGF表达的分布范围扩大，除在肾小球脏层上皮细胞表达阳性外，在部分肾小球壁层上皮细胞、系膜细胞也表达。结合肾脏病理变化和生化改变，可知VEGF与肾小球肥大、Ccr呈正相关，表明VEGF在DN血管增生中起了重要作用。这可能与其促进系膜细胞胶原合成，促进内皮细胞和足突细胞结构改变及改变肾脏血流动力学有关。然而，这些尚缺乏直接证据，需进一步探讨。

　　综上所述，在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型中，肾小球胞膜PKC活性、肾脏的TGF β1及VEGF表达随造模时间延长而显著增加，且表达强度与病情进展正相关，提示高血糖慢性刺激可引起肾小球PKC活性增高，进一步上调TGFβ1及VEGF的表达，这在糖尿病早期肾内血流动力学改变中发挥着重要的调控作用。

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