载脂蛋白E基因多态性与中国人2型糖尿病肾脏并发症的相关性研究

　　作者：张广吾 张爱珍 许则峰 作者单位：315041 浙江省宁波市李惠利医院(张广吾)　310000 浙江大学城市学院医学与生命科学学院 (张爱珍)　310000 浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所(许则峰)

　　【摘要】 目的 研究Apo E基因多态性与中国人2型糖尿病及其肾脏并发症(DN)的相关性。 方法 以Apo E基因为候选基因，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析法检测78例糖尿病患者和49例健康体检者的Apo E基因型，其中合并肾脏并发症40例，无肾脏病变(DRD) 38例。 结果 DN组Apo E的ε2等位基因频率明显高于DRD组和正常对照组(P<0.05)。DM患者的年龄、病程、高血压、GHB 及Apo E ε2等位基因频率与DN关系的Logistic回归分析：病程和Apo E的ε2等位基因与DN的发生密切相关(P<0.05)，病程对DN的OR值为1.1494，而Apo E的ε2等位基因对DN的OR值为7.6514。 结论 Apo E的ε2等位基因是2型DM并发DN的遗传易感因子。

　　【关键词】 糖尿病 载脂蛋白E基因 多态性

　　【Abstract】 Objective To investigate the relationship between apolipoprotein E(Apo E)gene polymorphism and Chinese patients with type 2 diabetes mellitus and diabetic nephropathy(DN) . Methods Apo E genotype was determined by PCR-RFLP in 78 diabetes(38 without DN ,40 with DN) and 49 non-diabetes as control. Results Significant heterogeneity was seen in Apo E genotypes between DN group and healthy control group (P<0.05), so as between DN group and DRD group (P<0.05). After the effects of other factors such as duration of history, age, GHB and hypertension were eliminated by Logistic regression, it was suggested that course of disease and Apo E e2 allele were closely related to the onset of DN(P<0.05). The OR of course of disease to DN was 1.1494，while the OR Apo E e2 allele to DN was 7.6514. Conclusions Apo E e2 allele is a genetic susceptible factors to type 2 diabetic nephropathy.

　　【Key words】diabetes apolipoprotein E(Apo E)gene polymorphism 糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)最常见的并发症之一，也是DM患者的主要死亡原因之一。其发病机制至今未完全阐明，国外研究表明载脂蛋白E(ApoE)基因多态性可能与DN发生有关[1]。本研究采用聚合酶链反应─限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析中国DM人群的Apo E基因分布与DN的相关性。报道如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　随机选择1998年7月至2000年2月2型DM患者78例为D组，男32例，女46例;年龄36～79岁，平均(61.21±10.09)岁。均符合WHO1999年诊断标准。按Mogensen 的DN分级标准，将不同时间2次尿白蛋白排泄率(UAER)均>30mg/24h者归入DN，其余归入糖尿病无糖尿病肾病组(diabetes without renal disease，DRD)。以上患者均排除相互间亲缘关系、原发性肾病或其他原因所致肾病、肝病及甲状腺功能异常。从健康体检人群中选择49例作正常对照组，男27例，女22例;年龄16～83岁，平均(55.20±14.85)岁。均排除DN、冠心病、Alzheimer病及肝病。

　　1.2 方法

　　Apo E基因型检测采用PCR-RFLP法分析。(1)人血白细胞DNA抽提 常规苯酚/氯仿法。(2)PCR扩增：引物链参照Richard P等设计的序列[2]：上链:5'-AACAACTGACCCCGGTGGCG3',下链:5'-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC3'。反应体系：总体积50μl,模板DNA 1μl,引物上链2μl,引物下链2μl,dNTPs 2μl，Taq酶0.5μl，DMSO液5μl,10×buffer/mg 2+5μl，ddH2O 32.5μl。反应在扩增仪(PERKIN ELMER GENAMP PCR SYSTEM 9600)上进行：95℃预变性5min，继而95℃变性45s、65℃退火30s、72℃延伸30s共30个循环，最后一步72℃延长10min，冷却至4℃。(3)目的片段检测和提纯：取PCR产物15μl+3μl loading buffer行1.5%琼脂糖电泳 (已加溴化乙锭) 目的片段检测，电泳条件为80V，45min。用2倍体积氯仿提纯PCR产物,去除DMSO等影响酶活性物质。(4)扩增片段的限制性酶切：酶切体系总体积20.2μl：提纯后PCR产物16μl, HhaI酶2μl,10×buffer(B) 2μl,BSA 0.2μl。置于65℃水浴过夜，次晨取出后置65℃水中10min，终止酶切反应。(5)酶切片段检测：取酶切产物3μl+3μl loading buffer,行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件为150V,65min,经染色显色,拍照并制膜记录结果。

　　1.3 临床参数与生化指标

　　(1)测量研究对象的血压、身高及体重：计算体重指数(BMI)=体重(kg)/身高2(m2);(2)糖化血红蛋白(GHB)测定：微柱法;(3)尿微量白蛋白测定：速率散射比浊法;(4)血脂检测：用酶法测定甘油三脂(TG)，总胆固醇(TC)及高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-c)。LDL-c测定采用比浊法。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS统计包。各组间Apo E等位基因频率用计数法获得，各组间Apo E等位基因频率比较用χ2检验;各项指标比较用t或t'检验;分析病程、HDL、高血压和ε2等位基因对DN发生的影响时用Logistic 回归分析。

　　2 结果

　　PCR扩增产物经酶切后，常见有6种基因型，其中ε2等位基因含91，83，60bp条带,ε3含91，60，48，35bp条带，ε4等位基因含72，60，48，35bp条带。DRD、DN组与正常对照组Apo E基因型、等位基因频率比较见表1、2。表1 DRD、DN组与正常对照组Apo E基因型频率比较(略)表2 DRD、DN组与正常对照组Apo E 等位基因频率比较(略)

　　按不同Apo E等位基因将所有DM患者分ε2(包括ε2/2、ε2/3)、ε3(包括ε3/3)、ε4(包括ε3/4、ε4/4)组，比较各组的临床指标见表3。DM患者的病程、年龄、高血压、GHB及Apo E ε2等位基因频率与DN关系的Logistic 回归分析：结果提示病程和Apo E的ε2等位基因与DN的发生密切相关(P均<0.05)，病程对DN的OR值为1.1494，而Apo E的ε2等位基因对DN的OR值为7.6514。而年龄、高血压和GHB则与DN的关系并无显著性，其相应的参数估计值βj的P值分别为0.3916、0.1250和0.9007。表3 不同Apo E等位基因组的各项临床指标比较(略)

　　3 讨 论

　　研究发现不同人种间Apo E等位基因频率差异与2型糖尿病不同并发症的发生有关[3]。本研究发现Apo E的ε2等位基因在DN人群中分布频率明显高于DRD组及正常对照组，而Apo E的ε4等位基因虽略高于另两组，却无显著性差异。多因素回归分析提示病程、Apo E的ε2等位基因和2型糖尿病合并肾病关系密切。与Chowdhury对英国高加索人群的大样本研究结果相符[4]。

　　目前对Apo E等位基因可能影响DM并发肾脏病变的机制尚未完全阐明，多数学者认为Apo E等位基因可能通过参与脂质代谢而间接影响DN的发生、发展。有实验证实高脂血症促进肾脏损害(如DN)的进展[5]。Apo E等位基因在正常人群中亦能显著影响血脂水平，血浆TC水平高低依次为ε4/4>ε4/3>ε4/2>ε3/3>ε3/2>ε2/2。而携带ε2等位基因者血浆TG含量均明显高于携带其他等位基因者。本研究在比较不同Apo E等位基因之间血脂水平后发现各组间血脂水平差异无显著性，这可能与DM患者接受饮食控制、适宜运动、降脂治疗等情况有关。但同时也提示Apo E基因多态性还可能通过其他更复杂途径影响DN的发生发展。

　　Sato H等[6]发现Apo E亦由系膜细胞表达，分泌入基质，并根据Apo E对细胞外物质葡糖胺聚糖的高亲和性，推测Apo E与某些生长因子作用紧密相连。这可能部分解释Apo E基因多态性对DN发病率的影响。另有学者[7]认为Apo E基因与其他功能基因可能在遗传学上的连锁不平衡致Apo E 和DN紧密相关。但这尚缺乏充足的实验证据。

　　本研究提示Apo E 的ε2等位基因与2型糖尿病合并肾脏并发症密切相关，是2型糖尿病合并肾脏并发症的遗传易感因子。鉴于本组例数有限应进一步深入研究，这将对早期预防和诊治糖尿病肾病有积极意义。

　　【参考文献】

　　1 Eto M， Saito M, Okada M, et al. Apolipoprotein E genetic polymorphism, remnant lipoproteins, and nephropathy in type 2 diabetic patients. Am J Kidney Dis,2002,40:243～251.

　　2 Richard P, Thomas G, Zμluera MP, et al. Common and rare genotypes of human apolipoprotein E determined by specific restriction profiles of polymerase chain reaction-amplified DNA. Clin Chem，1994，40:24.

　　3 Strachan MW, Frier BM, Deary IJ. Type 2 diabetes and cognitive impairment. Diabet Med,2003，20:1～2.

　　4 Chowdhury TA. Association of apolipoprotein E2 allele with diabetic nephropathy in Caucasian subjects with NIDDM. Diabetes，1998， 47:278.

　　5 Krolewski AS, Warram JH, Christlieb R. Hypercholesterolemia: A determinant of renal function loss and deaths in IDDM patients with nephropathy. Kidney Int，1994，45:125～131.

　　6 Sato H, Suzuki S, Kobayashi H, et al. Immunohistologica localiztion of apolipoproteins in the glomorμli in renal disease: Specifically Apo B and Apo E. Clin Nephrol， 1991，36;127～133.

　　7 Hideki K, Yoshiki S, Fumitake G，et al. Apolipoprotein E4 reduces risk of diabetic nephropathy in patients with NIDDM. Am J Kidney Dis， 1998， 31:666～673.