胰岛素抵抗大鼠血管内皮功能的研究

作者：何冰 赵晟 王艳军    作者单位：中国医科大学附属盛京医院内分泌科，辽宁 沈阳 110004

【关键词】  胰岛素抵抗 内皮功能障碍 游离脂肪酸 肿瘤坏死因子 α

　　内皮功能障碍作为动脉粥样硬化（AS）的始动环节，对其发生发展有重大影响。近年国外报道胰岛素抵抗(IR)可能导致内皮功能障碍，参与AS的发生及进展，是AS的又一危险因素，具体机制不清〔1〕。本研究采用高脂膳食诱导的IR大鼠模型，观察IR早期阶段血管内皮细胞功能变化，旨在进一步探讨IR与内皮功能障碍之间的关系及作用机制，为开展AS的早期干预提供实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物与分组

　　4 w龄雄性Wistar大鼠20只，体重70～90 g,生产批号SYXK20030019，购自中国医科大学实验动物中心。适应性饲养1 w后，随机分为正常对照组（n=10）和高脂组（n=10）。饲料均由中国医科大学实验动物中心配制，常规饲料热量组成：糖类64%、蛋白质23%、脂肪13%，高脂饲料：糖类24%、蛋白质21%、脂肪55%（脂肪主要来自炼猪油），每日热量310 kJ/只。大鼠单笼饲养，自由饮水，明暗周期12 h，室温（22±1）℃，湿度50%，喂养8 w。

　　1.2  高胰岛素

　　正血糖钳夹试验  大鼠禁食12 h（不禁水），腹腔注射10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉。股静脉、股动脉插管留置，静置30 min后，股动脉取血测基础血糖（BBG），一台输液泵恒速输注胰岛素溶液（5 mU·kg-1·min-1）,一台输液泵同时输注20%葡萄糖，每5～10 min测血糖，调整葡萄糖输注速度，使血糖稳定在（BBG±0.5）mmol/L,记录稳态下4～5次GIR，取平均值。

　　1.3  生化指标测定

　　分组饲养8 w后，禁食12 h内眦静脉取血，专人同批测定。血糖检测采用葡萄糖氧化酶法，仪器为 Biosen 5030，德国；胰岛素用酶联免疫吸附法测定，Linco公司大鼠专用药盒，批内CV5%～6%；FFA采用比色法检测，药盒购自南京建成生物公司，批内CV＜2%；血脂测定用酶法，由Abbortt Arrosset全自动生化分析仪完成；TNFα检测采用放免法，药盒由上海朗卡科技有限公司提供，批内CV3.35%～4.23%。

　　1.4  血管内皮功能观察

　　分离胸主动脉，分别置于液氮中和制成石蜡标本。

　　1.4.1  免疫组化检测血管内皮细胞内的eNOS表达  　　采用EnvisionTM二步法，兔抗大鼠eNOS第一抗体（博士德公司产品），工作浓度为1∶160，二抗为生物素标记的EnvisionTM抗兔抗体，AEC显色，常规设阳性对照，利用Axioplan 2 imaging 显微图像分析系统测定eNOS阳性着色面积（%）和平均吸光度，以阳性着色面积×平均吸光度计算eNOS相对表达量。

　　1.4.2  血管壁NO测定

　　取动脉约50 mg，加入1∶10冷生理盐水，匀浆，10 000 r/min离心5 min,取上清液100 μl，紫外分光度仪（导津UV265 FM，日本）测定NO含量。

　　1.5  内脏、皮下脂肪测定  　　取附睾白色脂肪垫称重，记为内脏脂肪，并计算其占体重百分比，取腋下脂肪称重，记为皮下脂肪，计算其占体重百分比。

　　1.6  统计学处理

　　所有数值以x±s表示，采用SPSS11.5软件包进行统计学处理。两组间差异比较用t检验，变量相关关系用直线相关和多元线性回归分析。

　　2  结  果

　　2.1  大鼠体重与体脂分布变化

　　5 w龄时两组大鼠体重差异无显著性，饲养8 w后两组体重仍无差异，内脏脂肪占体重百分比，高脂组是对照组的1.8倍（P=0.015），皮下脂肪占体重百分比，两组差异无统计学意义。高脂喂养8 w后大鼠出现了特异性的腹型肥胖，见表1。表1  两组大鼠体重、体脂分布变化(略)

　　2.2  大鼠血糖、胰岛素、FFA、血脂、TNFα变化

　　入选时两组大鼠生化指标均可比，饲养8 w后，与对照组比较，高脂组FFA升高有统计学意义（P=0.016）；TG水平高脂组较对照组升高1.4倍（P=0.002）；高脂组TNFα水平明显升高，是对照组的3倍（P＜0.001）。血糖、胰岛素、TC、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）间无差异，见表2。表2  两组大鼠化资料(略)

2.3  大鼠胰岛素敏感性比较

　　两组大鼠稳态输入胰岛素水平相同，维持相同的稳态血糖所需的GIR，高脂组为（19.29±2.85）mg·kg-1·min-1,而对照组为（2.59±0.95）mg·kg-1·min-1,有显著性差异（P=0.001），高脂组大鼠存在明显的IR。

　　2.4  血管内皮细胞eNOS相对表达量及血管壁NO含量比较

　　血管内皮细胞eNOS相对表达量对照组为43.32±19.77，高脂组为1.30±0.22，有显著性差异（P=0.001）。对照组血管壁NO含量（142.67±4.81）μmol/mg pro,而高脂组（85.38±7.29）μmol/mg pro，两组差异有统计学意义（P＜0.001）。

　　2.5  相关分析

　　多元线性回归分析显示，血管壁NO含量与FFA（r=-0.52，P=0.001）、TNFα(r=-0.37，P=0.013)呈显著的负相关；另外，直线相关分析表明GIR与血管壁NO含量之间存在相关性（r=0.51，P=0.001）。

　　3  讨  论

　　高脂饮食造成的IR是由于环境改变引起IR的动物模型，目前认为这种模型与人肥胖时的IR状态最相似。本研究以高脂膳食为处理因素，持续喂养大鼠8 w后，用能准确评价胰岛素敏感性的钳夹技术，观察到高脂组大鼠GIR明显小于对照组，证实其确实存在IR。

　　血管内皮功能异常表现为缩血管因子作用超过舒血管因子的作用，通常是由于NO生物活性降低所致。eNOS调控NO产生，eNOS基因敲除大鼠易发生AS，说明NO对血管具有重要保护作用，给与eNOS抑制剂有同样的结果〔2〕。本研究观察了两组大鼠动脉细胞质中eNOS表达，发现IR大鼠较无IR大鼠表达量明显降低，IR影响了内皮细胞的eNOS合成和表达。进一步对两组大鼠血管壁NO含量检测，发现IR大鼠血管壁NO含量明显减少，考虑是eNOS分泌减少、活性下降的直接结果。上述观察证实在IR早期阶段，血糖仍在正常范围时，大鼠已经出现了内皮功能障碍。

　　饮食造成的IR状态下的内皮功能障碍机制尚不清楚。目前认为可能与FFA、TNFα、四氢叶酸等因素有关〔3〕。胰岛素与受体结合后，使胰岛素受体底物1、2磷酸化，进而活化蛋白激酶B（PKB），活化后的PKB激活eNOS，释放NO。FFA升高时，各环节均受损〔4〕；升高的FFA还可以激活血管组织中的蛋白激酶C，使eNOS基因表达水平下降；同时减弱细胞内Ca2+信号转导，抑制Ca2+依赖的eNOS活性〔5〕。在本研究中，IR大鼠血中FFA水平升高，且血管壁NO含量受其显著影响，因此推测高脂喂养的IR大鼠，血浆FFA升高可能是造成内皮功能障碍的原因之一。对TNFα检测发现，两组大鼠TNFα浓度差异有显著性，且血管壁NO含量与其呈负相关。国外研究发现TNFα增多可能会使超氧化物产生增多而损害内皮细胞，还可使eNOS的半衰期缩短，导致NO产生减少，活性降低〔6〕。

　　血管内皮通过NO调节组织器官的血流量，影响胰岛素向靶组织转运，IR导致内皮功能障碍后血管不能充分舒张，胰岛素无法充分到达靶组织，使胰岛素不能发挥应有的生物效应，IR程度加重〔7〕。本研究也观察到代表IR程度的GIR与血管壁NO含量间呈现出显著的相关性。可见，IR与内皮功能障碍相互促进，对机体代谢及循环系统均产生不良影响。

【参考文献】  　　1 Wheatcroft SB，Williams IL,Shah AM,et al.Pathophysiological implications of insulin resistance on vascular endothelial function〔J〕.Diabet Med，2003；20（14）:25568.

　　2 Hsueh WA，Lyon CJ，Quinones MJ.Insulin resistance and the endothelium〔J〕.Am J Med，2004；117（2）:10917.

　　3 向光大.胰岛素抵抗与血管内皮功能〔J〕.中华糖尿病杂志，2005；13（5）：3213.

　　4 O′Brien SF，Russell JC，Dolphin PJ,et al.Vascular wall function in insulinresistant JCR:LACP rats：role of male and female sex〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2000；36:17681.