人肝星形细胞胰高血糖素样肽1受体的表达

　　近年来，以胰高血糖素样肤GLP-1受体为治疗靶点的“GLP-1受体激动剂在临床上被广泛用于改善2型糖尿病的进程。目前发现不仅胰岛R细胞上存在GLP-1受体，人体其他组织如心脏、肝脏、甲状腺、脑等组织中也具有GLP-1受体并发挥着一定的生理作用.GLP-1了刺激与改善胰岛R细胞功能之外的生理功能远未揭示，已有研究表明，GLP-1对脏器纤维化(包括肝纤维)有一定的对抗作用,由于肝纤维化发生的中心环节是肝星形细胞(Hsc)活化并导致细胞外基质过量沉积，可以推测GLP-1抗肝纤维化最有可能是通过HSC上的GLP-1受体及之后的信号通路调控其活化凋亡等生物学行为而实现。本文通过体外培养人HSC，并用分子生物学手段成功验证了HSC上GLP-1受体的存在，并逆转录出该受体的编码基因，现报道如下。　　材料与方法　　一、材料　　人HSC细胞株LI-90来自中山大学实验动物中心，L-DMEM培养基为美国GIBCO公司产品，小牛血清购自成都哈里生物工程有限公司，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、GLP-1受体和GAPDH的一抗及二抗购自武汉博士德生物工程有限公司，ECL化学发光试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，GLP-1受体的引物及Taq酶、逆转录酶,dNTP、等PCR耗材购自上海生工生物工程有限公司。　　二、方法　　1.人HSC培养人HSC复苏后接种于塑料培养瓶中，37qC、体积分数为5%的CO:饱和湿度培养箱中常规培养，培养液为含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM，每3天换液1次。72h后提取样本于倒置显微镜下进行形态学鉴定，并进行后续实验分析。　　2.免疫印迹法检测GLP-1受体蛋白的表达　　(1)配制聚丙烯酞胺胶板并移至电泳槽内加人Tris一甘氨酸缓冲液，取25匹样本蛋白进行SDS-PAGE电泳分离样本蛋白质，电泳完毕后转移凝胶至电转印板中，然后电转印(150mA,1.5h)到NC膜上，TBS漂洗10minx(2)NC膜在封闭液(TBS/T加人终浓度为5%的脱脂奶粉)中室温孵育2h,TBS/T漂洗3次，每次5mina(3)用封闭液稀释的一抗(GLP-1受体1:1000)2mL，轻微震荡下室温孵育NC膜2h,TBS/T漂洗3次，每次5min,(4)用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记二抗(1:5000)3mL，轻微震荡下室温孵育NC膜1h,TBS/T漂洗3次，每次5min。最后用TBS洗涤1次。(5)膜片应用ECL试剂盒发光，胶片曝光、显影、定影，在凝胶成像分析系统中扫描分析。(6)同时设立(}APDH为内参，作半定量分析。　　3.RT-PCR检测样本GLP-1受体mRNA的表达　　(1)引物合成:GLP-1受体:Senses'-CTCGGTCT-TATCT(执GCAATG-3'，Antisense5'-GTGTCAGCGTG-GACTT“一‘，长度296byo(2)总RNA提取与RT-PCR:各取约50一100mg细胞，采用TRIZOL试剂盒提取总RNA，使用分光光度计在260/280nm处检测总RNA的质量和纯度。使用cDNA合成试剂盒将mRNA反转录为cDNAocDNA采用相应引物进行PCR扩增:25}L的反应体系包括1,uL上、下游引物(各0.5}cL),0.124}L的Taq聚合酶、5}LcDNA,13}峡菌蒸馏水和5}L5xPCRBufferoPCR反应过程:94℃热启动2min后，进行94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延长2min共35个循环。(3)电泳与鉴定:取PCR反应产10}cL，在20目L琼脂糖凝胶上电泳30min，取凝胶用凝胶成像分析系统扫描分析。(4)设立(3-actin(Senses‘一GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3',Antisense5'-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3')为内参，作半定量分析。　　结果　　一、人HSC细胞形态学鉴定　　倒置显微镜下可以观察到活化的HSC为扁平状，胞体大，具有发育良好的应力纤维，胞浆内缺乏脂肪滴，见图1(封三)。　　二、人HSC上《}LP-1受体mRNA的表达　　HSC总RNA中逆转录出cDNA后进行PCR扩增，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像分析系统中成像分析，结果如图2所示，扩增的GLP-1受体基因片段长度为296by。扩增的目的条带清晰，未发现非特异性扩增条带。经TIANGEN公司测序鉴定表明目的基因GLP-1受体扩增所得序列与GenBank公布的人GLP-1受体cDNA序列(NM-002062.3)相应部分相符度为100%.　　三、人HSC上GLP-1受体蛋白的表达免疫印迹法以GAPDH为内参，测定(}LP-1受体蛋白的表达情况见图3。本实验9个样本均测得GLP-1受体蛋白表达，免疫印迹结果用增强化学发光法后经凝胶成像分析系统分析:GLP-1受体蛋白相对内参GAPDH蛋白的吸光度比值均数为(29.7014.94)%，见表to讨论GLP-1是回肠和结肠L细胞分泌的一个肠促胰岛素，它能作用于胰腺俘细胞，在足够葡萄糖浓度的背景下刺激胰岛素分泌。以(;LP-1受体为靶点的2型糖尿病治疗药近年来逐步兴起，如利拉鲁肤、艾塞那肤等(:LP-1受体激动剂。目前发现该类药物的生理药理作用远远不止于葡萄糖依赖性降糖和改善俘细胞功能，他们在心血管保护，抗脏器纤维化等方面可能存在着更多更有意义的作用。　　GLP-I受体在人体内广泛存在，胰腺、肝、脑、心脏、甲状腺等组织上均有GLP-I受体的表达‘-4-'cPark等给予8周龄雄性db/db小鼠应用长效GLP-I受体激动剂利拉鲁肤治疗8周后发现:小鼠肾小球肥大、系膜基质扩张、TGF;31的表达和W型胶原蛋白的沉积均明显减少。新近Hillman等发现:相比正常人，囊性纤维化的患者体内活性GLP-1受体水平存在显著性的下降。国内汤秀英等〔7〕曾应用电镜观察使用GLP-1治疗8周后的OLETF大鼠肺毛细血管内皮基底膜厚度发现:与基线相比，GLP-I干预后OLETF大鼠肺毛细血管内皮基底膜厚度明显降低。　　GLP-1受体介导的抗脏器纤维化作用已经初步得到证实，其机制非常复杂，在不同的脏器中可能存在不同的作用通路，并且一些参与脏器纤维化的关键细胞如肺成纤维细胞、HSC等最有可能参与其中。张宏等经91已报道肺成纤维细胞上存在GLP-1受体，使用GLP-1激活该受体后能在一定程度上抑制肺纤维化的进展。对肝纤维化而言，HSC活化并导致细胞外基质过量沉积是其病理的中心环节,HSC是肝纤维化的主要效应细胞，其活化与调亡之间的平衡控制着肝纤维化的进展。　　那么，作为肝纤维化的关键细胞—HSC上是否存在GLP-1受体的表达?本文通过体外培养人IISC，从水平和蛋白水平上证实了HSC上GLP-1受体的客观存在，这提示现有的GLP-1受体激动剂，在HSC上存在作用靶点。作者认为:深人研究HSC的GLP-1受体及其后续通路，有助于阐明GLP-1抗肝纤维化的机制，有助于以受体为靶点的一类降糖药在肝纤维化治疗领域的拓展应用，有助于糖尿病性脂肪肝肝纤维化的早期干预，具有较大的社会意义和经济价值。　　参考文献　　Monji A,Mitsui T,Bando YK. Glucagon-like peptide-1 receptor activation reverses cardiac remodeling via normalizing cardiac steatosis and oxidative stress in type 2 diabetes[J/OL].American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology,2013.　　Lockie SH. The GLP-1 receptor in the brain:role in neuroendocrine control of energy metabbolism and treatment target for obesity[J].Journal of Neuroendocrinology,2013,(07):597-604.　　Gupta NA,Mells J,Dunham RM. Glucagon-like peptide-1 receptor is present on human hepatocytes and has a direct role in decreasing hepatic steatosis in vitro by modulating elements of the insulin signaling pathway[J].Hepatology,2010,(05):1584-1592.　　Gier B,Butler PC,Lai CK. Glucagon like peptide-1 receptor expression in the human thyroid gland[J].Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism,2012,(01):121-131.　　Park CW,Kim HW,Ko SH. Long-term treatment of glucagonlike peptide-1 analogexendin-4 ameliorates diabetic nephropathy through improving metabolic anomalies in db/db mice[J].Journal of the American Society of Nephrology,2007,(04):1227-1238.doi:10.1681/ASN.2006070778.　　Hillman M,Eriksson L,Mared L. Reduced levels of active GLP-1 in patients with cystic fibrosis with and without diabetes mellitus[J].Journal of Cystic Fibrosis,2012,(02):144-149.　　汤秀英,工星,郭晓蕙. 胰高血糖素样多肽1对OLETF大鼠肺泡毛细血管基板的影响[J].北京大学学报（医学版）,2008,(02):178-180.doi:10.3321/j.issn:1671-167X.2008.02.015.　　Park CW,Kim HW,Ko SH. Long-term treatment of glucagon-like peptide-1 analog exendin-4 ameliorates diabetic nephropathy through improving metabolic anomalies in db/db mice[J].Journal of the American Society of Nephrology,2007,(04):1227-1238.doi:10.1681/ASN.2006070778.　　张宏,姜丽娟,孙蓓. TGF-B1/Smad信号转导通路在0LETF大鼠肺细胞外基质改变中的作用及GLP-1干预效应的研究[A].北京:中华医学会杂志社,2011.　　Friedman SL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis[J].Gastroenterology,2008,(06):1655-1669.doi:10.1053/j.gastro.2008.03.003.