Notch1和Hes1、Hes5在星形细胞瘤中的表达及其相关性研究

　　作者：王春华 郑志竑， 杨卫忠， 陈春美 作者单位：福建医科大学1.分子医学研究中心，福州 350004;2.附属协和医院神经外科、福建神经外科研究所,福州 350001

　　【摘要】目的 探讨Notch1受体和其下游信号分子Hes1、Hes5在人脑星形胶质细胞瘤中的表达及其相关性。 方法 应用免疫组织化学方法检测62例人脑星形细胞瘤和7例正常人脑组织中Notch1和Hes1、Hes5表达情况。 结果 星形细胞瘤组Notch1、Hes1和Hes5的表达均显著强于正常脑组织组(P<0.05)。在各级星形细胞瘤中， Notch1和Hes1的表达水平Ⅱ～Ⅲ级显著高于Ⅳ级(P<0.05)，Hes5的表达在2组间差别无统计学意义(P>0.05)。在星形细胞瘤组中Notch1的表达与Hes1一致性较好(k=0.503)，与Hes5的表达一致性差(k=0.216)。 结论 Notch1表达与星形细胞瘤的发生有关，与星形细胞瘤的病理分级无关。Notch1可能主要是通过下游分子Hes1而非Hes5发挥作用。

　　【关键词】 蛋白质类 信号传导 基因表达 星形细胞瘤 脑肿瘤 细胞分化 免疫组织化学

　　Notch信号在神经系统的发育过程中对细胞增殖和分化的调控起关键性作用。该信号通路的失调与多种神经系统肿瘤形成密切相关[1]。神经胶质细胞瘤是最常见的原发性脑肿瘤，已有研究报道，在神经胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中均检测到Notch1受体的异常表达[26]，但Notch信号通路中其主要的下游信号分子Hes1和Hes5在胶质瘤中表达情况及其与胶质瘤发生、发展的相关性以及作用机制尚不明确。本实验通过免疫组织化学方法检测Notch1与Hes1、Hes5在正常脑组织和星形胶质瘤组织中的表达情况，并分析三者的相互关系，旨在探讨NotchHes信号途径与星形胶质瘤发生、发展的关系及其可能的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 组织标本 收集福建医科大学附属协和医院神经外科2006年1月-2008年6月手术切除的胶质瘤标本62例，男性39例，女性23例，年龄(44.39±16.6)岁(10～72岁)。均经病理证实。按WHO(2004)分型标准分类：Ⅱ级21例，Ⅲ级20例，Ⅳ级21例。另收集7例脑外伤内减压手术中切除的脑组织作为对照。

　　1.1.2 主要试剂 兔抗人Notch1多克隆抗体、兔抗人Hes1多克隆抗体、兔抗人Hes5多克隆抗体(美国Chemicon公司)。二步法免疫组化检测试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司);DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组织化学染色 10%福尔马林液固定，常规石蜡包埋、切片、脱蜡和煮沸抗原修复，采用免疫组织化学二步法分别检测Notch1和Hes1、Hes5蛋白的表达，抗体稀释倍数均为1∶200。以PBS代替一抗作为阴性对照, 用已知的阳性片作为阳性对照。常规DAB显色，苏木素复染，封片后光镜下观察。

　　1.2.2 结果判定 细胞核或细胞质中均可见Notch1、Hes1、Hes5三者表达。在染色均匀的肿瘤区随机选择5个以上高倍视野，计数≥500个细胞。根据细胞着色深浅程度及着色细胞百分率评分：基本不着色为0分，着色淡为1分，着色较深为2分;着色细胞数占计数细胞总数的百分率：≤5%为0分，6～25%为1分，26～50%为2分，≥51%为3分。将每张切片着色深浅程度与着色细胞百分率得分相乘的积作为最后得分。0分为阴性(-)，1分为弱阳性(+)，2～3分为阳性()，4～6分为强阳性()。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，以等级资料Wilcoxon秩和检验和Kappa一致性检验分析实验数据。P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 星形细胞瘤及正常脑组织中Notch1、Hes1、Hes5的表达情况 星形细胞瘤各级别组织中均检测到Notch1、Hes1、Hes5不同程度的表达(图1)，三者阳性率分别为69.4%，61.3%，38.7%。正常脑组织中仅有1例检测到Notch1、Hes1的表达，均未检测到Hes5表达。星形细胞瘤组织Notch1、Hes1、Hes5的表达显著高于正常脑组织组(表1)。

　　2.2 星形细胞瘤各级别组织中Notch1、Hes1、Hes5的表达及相关性分析 在62例星形细胞瘤组织中，Ⅱ～Ⅲ级组中Notch1和Hes1的表达明显强于Ⅳ级组(P<0.05)(表1，图1A，B，D，E)，Hes5的表达在两组间差别无统计学意义(P>0.05，图1C，F)。其中Notch1与Hes1的表达在星形细胞瘤组织中差别无统计学意义(P>0.05)，进一步行Kappa一致性分析，发现两者表达具有较好的一致性(k=0.503，表2)，而Notch1与Hes5的表达具有显著性差异(P<0.01)，表达一致性差(k=0.216)。

　　A:Notch1在Ⅱ级星形细胞瘤中的表达();B:Hes1在Ⅱ级星形细胞瘤中的表达();C：Hes5在Ⅱ级星形细胞瘤中的表达(+);D: Notch1在Ⅳ级星形细胞瘤中的表达(+);E: Hes1在Ⅳ级星形细胞瘤中的表达(+);F: Hes5在Ⅳ级星形细胞瘤中的表达(+).表1 星形细胞瘤与正常脑组织中Notch1、Hes1、Hes5的表达表2 Notch1与Hes1在星形细胞瘤组织表达相关性

　　3 讨 论

　　Notch信号通路是一条进化保守的信号通路，其经典的信号传递方式是通过Notch受体与配体的结合，引起受体的连续水解后释放其胞内域(NICD)而活化，NICD与CSL(一种DNA结合蛋白)结合激活下游的Hes等基因表达，Hes是bHLH样的转录因子，可调控诸多与细胞增殖、分化等相关的基因的表达。目前已知，除了经典的途径外，还可以通过不需CSL调控的途径，作用于其它靶分子或通过与其它信号途径的交叉网络发挥作用。Notch信号对于细胞的生长发育具有多样化的影响,在不同组织细胞可能表现不尽相同，它可促进或抑制细胞增殖、分化和凋亡。已有许多研究显示，Notch1受体的异常表达与多种实体肿瘤的发生相关，如宫颈癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、皮肤癌等[710]。在神经胶质细胞瘤的形成机制的研究中，也有越来越多的研究报道检测到Notch1受体在胶质瘤中的异常表达，但作为Notch下游效应分子的Hes1和Hes5在胶质瘤中的表达报道不一[26]。

　　本研究结果表明，Notch1、Hes1、Hes5在星形细胞瘤组织中均有不同程度表达，正常脑组织组中只检测到少量Notch1、Hes1表达，且表达水平明显低于星形细胞瘤组。在星形细胞瘤中Notch1与Hes1的表达具有较好的一致性(k>0.5)、而与Hes5的表达一致性较差(k=0.216)，提示Notch1表达与星形细胞瘤的发生密切相关，并且可能通过激活经典的NotchHes信号途径中下游效应分子Hes1发挥作用。但由于Notch1还可能作用于其它靶基因(如：CyclinD1、p21、NFκB)或者通过与其他信号通路(如：BMP/TGFbeta，JAKSTAT，Ras and HIF)的交互作用参与星形细胞瘤的发生[1015]，加上Hes本身还受到其它信号途径的调节，因此，Hes1/Hes5二者与星形细胞瘤发生、发展的关系以及它们与Notch1在该瘤中的确切关系，还有待进一步研究证实。同时，本研究也发现，Notch1在星形细胞瘤Ⅱ～Ⅲ级与Ⅳ级组之间的表达存在显著差异(P<0.01)，Ⅳ级组的Notch1表达反而较弱。Purow等有类似报道，认为Ⅳ级胶质瘤可能是由于Notch1的下调和其配体JAG1的上调，通过增强AP1的活性而促进瘤血管的形成和瘤细胞侵袭[2]。提示Notch1在胶质瘤的发展过程中可能呈动态的变化，通过其作用的多样性而影响肿瘤的生物学特性。

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