近交系胎鼠中脑多巴胺能神经元体外定向分化的初步研究
发表时间：2009-06-30 浏览次数：858次
作者：王晓东,贡志刚,兰青,黄强
作者单位：（苏州大学附属第二医院神经外科，江苏苏州215004）
【摘要】 目的体外培养近交系大鼠胚胎腹侧中脑前体细胞（VMP）并诱导其分化为多巴胺能神经元（DN），为研究DN定向分化的分子机制提供细胞模型。方法取材胎龄11d的近交系大鼠胚胎VMP，体外用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）增殖培养7d后换用L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐（AA-2P）诱导分化为DN，随后进行免疫荧光染色鉴定。结果细胞总数扩增49.76倍，免疫荧光染色显示β-TubulinⅢ阳性的神经元中（71.33±20.42）%为TH阳性的DN，后者占细胞总数的（24.85±12.85）%。结论近交系大鼠VMP经体外原代培养能够得到较高比例的DN，可作为深入研究DN定向分化分子机制的细胞模型。
【关键词】 近交系；中脑；前体细胞；多巴胺能神经元
Preliminarystudyofinvitrocommitteddifferentiationofdopaminergicneurons
inthemidbrainofinbredratembryos
WANGXiaodong,GONGZhigang,LANQing,etal
DepartmentofNeurosurgery,SecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215004,China
Abstract:ObjectiveToestablishacellmodelforstudyingthemolecularmechanismofcommitteddifferentiationofdopaminergicneurons(DNs),bymeansofinvitroculturingventralmesencephalicprecursors(VMPs)frominbredratembryos.MethodsVMPsharvestedfromventralmesencephalonofE11inbredratembryoswereproliferativelyculturedinvitrowithbFGFfor7days,anddifferentiatedintodopaminergicneuronsinfree-bFGFmediumsupplementedwithAA-2P.ImmunofluorescencestainingwasperformedtoevaluatetheyieldofDNs.ResultsThetotalcellnumberincreasedabout49.76folds.Amongthesecells,nearly(24.85±12.85)%weretyrosinehydroxylase(TH)-positivecells(DN),whichmadeupabout(71.33±20.42)%ofβ-TubulinⅢ-positiveneurons.ConclusionVMPsofinbredratembryoscandifferentiateintoconsiderableDNsinvitro,whichthereforecanbeusedasanidealcellmodelforexploringthemolecularmechanismofDNdifferentiation.
Keywords:inbredline;mesencephalon;precursor;dopaminergicneuron帕金森病（PD）的主要病理基础是中脑黑质多巴胺能神经元（DN）特异性变性坏死，具体原因尚不明了。近年来，有关调控中脑DN发育的分子机制受到越来越多的重视。本实验尝试取材近交系大鼠胚胎腹侧中脑前体细胞（VMP）进行体外培养并诱导其分化为DN，以建立用于研究DN分化相关分子机制的细胞模型。
1材料与方法
1.1动物与材料近交系Wistar孕鼠（＞36代，体质量约300g，中国科学院上海试验动物中心提供）。试剂：DMEM、F12、N2、B27、L-Glutamin、Neurobasal培养液购自Gibco公司。L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐（AA-2P）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、多聚鸟氨酸均购自Sigma公司。免疫细胞化学所用抗体：联脒二苯吲哚（DAPI，Sigma公司）、小鼠抗酪氨酸羟化酶（TH）单克隆抗体（Sigma公司）、兔抗β-TubulinⅢ抗体（Corance公司）、AlexaFluor488标记羊抗兔IgG（MolecularProbes公司）、Cy3标记羊抗小鼠IgG（Dianova公司）。胎牛血清（FBS，杭州四季青）及山羊血清（PAA公司）。仪器：体视显微镜（泰克，XTL20）、CO2细胞培养箱（ESPECBNA-311）、倒置相差显微镜（XDS-1B）、激光共聚焦显微镜（ZiessLSM410）、流式细胞仪（BectonDickinsonFACSCalibur）。
1.2细胞取材胎龄11d（以下简称E11）的孕鼠乙醚麻醉后，腹部消毒，无菌条件下取出暗红色串珠样子宫，置于盛有PBS的培养皿中。剪开子宫，取出胚囊，用镊子撕破胚膜，取出冠臀径5~6mm的胚胎。体视显微镜下剪取中脑曲，剪开中脑背侧，切取中脑腹侧近中线约0.6mm×0.8mm×0.3mm的组织，去除脑膜。收集好所有组织块后反复吹打成单细胞悬液，苔酚蓝计数后，按7×103细胞/cm2接种于涂有多聚鸟氨酸的24孔板内。每孔中加扩增培养基（2∶1的DMEM/F12、2g/L碳酸氢钠、2%B27、1%N2、20ng/mlbFGF、1%FBS）250μL，置37℃、5%CO2培养箱中培养。
