BCNU缓释微球稳定性的影响因素

作者：马晓东,章文斌,周定标    作者单位：100853 北京,解放军总医院神经外科

【摘要】  目的 探讨用于脑胶质瘤间质内化疗的BCNUPLGA缓释微球稳定性的影响因素。 方法 以溶剂挥发萃取法制备BCNUPLGA缓释微球，HPLC测定微球内成分，并与空白PLGA微球比较。结果 微球冷藏贮存6个月后,外观形态无明显变化，以高效液相色谱方法测定微球溶解后BCNU色谱峰，发现与新鲜配制的BCNU标准品出峰时间和形态一致，微球溶解后BCNU色谱峰表现为单一尖锐峰形，表明药物在微球内部保持结构和成分的稳定。结论 BCNUPLGA缓释微球具有良好的稳定性，可以满足间质内缓释化疗的需要。

【关键词】  BCNU；缓释；间质内化疗

    Influential factors of stability to BCNUPLGA sustained release microspheres  MA Xiaodong,ZHANG Wenbin,LIU  Hongyi, et al.Department of Neurosurgery, PLA General Hospital, Beijing 100853,CHINA

    Abstract:Objective  To explore the influential factors of stability to BCNUPLGA sustained release microspheres used for interstitial chemotherapy to brain glioma. Methods  BCNUloaded PLGA microspheres are fabricated and prepared by solvent evaporation and extraction, components are determined by HPLC, and compared with blank loaded microspheres. Results  Morphous without significant difference, chromatographic peak are identified between  solved BCNU and fresh prepared BCNU standard solution, the chromatographic curve  after solved is signal cutedge one, indicated that the drug remaind stable inside the microspheres.Conclusions  Stability of BCNUPLGA sustained release microspheres is well enough to satisfactory the requisition of interstitial sustained release chemotherapy.

    Key words:BCNU;sustained release; interstitial chemotherapy

     脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤，手术不能完全切除，术后极易复发。近年的研究提示，间质内化疗即在肿瘤局部直接给药,可绕过血脑屏障，直接作用于肿瘤细胞，减少全身用药的毒副作用，大大提高肿瘤局部的药物浓度，达到较好的化疗效果，是治疗脑胶质瘤的一种颇有应用前景的化疗方法。但化疗药物在缓释微球内部能否保持长久的稳定性，对此我们进行探讨。

    1  资料和方法

    1.1  药品与试剂  BCNU天津金耀氨基酸有限公司生产，纯度99.8%，冷藏保存。 PLGA日本和光纯药工业株式会社生产，冷藏保存；聚乙烯醇,甲基纤维素,二氯甲烷,甲醇,二甲基甲酰胺,去离子水。

    1.2  仪器  SartoriusBP121S型微量分析天平；数显无极调速交流搅拌器，水循环式真空泵，TOSHIBA 800S扫描电子显微镜，Agilent 1100型高效液相色谱仪。

    1.3  微球制备方法  1.5%聚乙烯醇（PVA）溶液：聚乙烯醇置于生理盐水中，70℃加热溶解。并加入0.05%甲基纤维素。PLGA二氯甲烷溶液：PLGA溶解于6 ml二氯甲烷中。BCNU粉末12.5 mg溶解于1ml甲醇，PLGA聚合体250 mg溶解于6 ml二氯甲烷中，两溶液混合，以22G注射器针头滴入50 ml含0.05%(w/v)甲基纤维素（methyl cellulose，MC）和1.5%(w/v)聚乙烯醇（poly(vinyl alcohol)，PVA）的生理盐水溶液（0.9%w/v）中800转/分搅拌30 min乳化。室温下500转/分搅拌3 h，直至二氯甲烷、甲醇完全挥发。得到的微球以100 ml去离子水洗2次，分别过120目筛和200目筛以除去大颗粒，4.5 μm滤膜抽滤，30 min后以自制不锈钢模具压成片形(20 kgf/cm2,5 s,室温)，直径3 mm，厚度1 mm，低温下干燥器内干燥过夜，抽真空6 h，收集样品放入干燥箱内保存以备后续测试，全部操作过程均在避光条件下进行。BCNU：PLGA比例为5%，微球以60Co为放射源15.0 kGy γ射线照射消毒，0℃储存备用。

    1.4  PLGA微球中BCNU稳定性的观察  微球置入磷酸盐缓冲溶液PBS内（137mM NaCl，3mM KCl，8 mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，pH=7.4）进行药物释放,在不同时间点（1 d、1 w、2 w）从释放介质中取出微球，以去离子水冲洗药片表面以除去释放到表面的BCNU，冷冻干燥，以二氯甲烷溶解微球，高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定微球内成分，并与空白PLGA微球比较。

    2  结  果

    2.1  微球的形态学表现  光学显微镜和扫描电子显微镜显示，空白微球呈白色粉末状，分散性好，大小均匀，表面光滑、致密，无裂隙及孔洞，球形圆整。包载BCNU后微球呈微黄色，对微球表面没有显著的影响，大多数微球呈球状，表面光滑，球形良好，没有孔隙或裂纹，聚集现象不明显，表面未观察到药物结晶的存在，证明药物包裹在微球内部。

    2. 2  PLGA微球中BCNU稳定性分析  微球置于冰箱4℃条件下贮藏6个月后,外观形态无明显变化,说明BCNUPLGA微球的稳定性良好。以高效液相色谱方法测定微球溶解后BCNU色谱峰，发现与新鲜配制的BCNU标准品出峰时间和形态一致，微球溶解后BCNU色谱峰表现为单一尖锐峰形，表明药物在微球内部保持结构和成分的稳定。

    3  讨  论

    间质内缓释化疗是指将药物与可降解多聚物缓释材料结合后直接植入术后瘤腔进行化疗。可降解多聚物分子内有一定的空间分子结构，药物被包裹其中，聚合物分子降解的同时释放出其中的化学药物。BCNU是治疗脑肿瘤的重要的化疗药物，被认为是脑肿瘤化疗的“金标准”［1］，并作为其他化疗方案效果判定的标准［2］，分子量214，可以通过血脑屏障，具有高脂溶性、生理pH值离子化程度低、血浆蛋白结合率低等特点［3］，常用于治疗原发和转移性脑肿瘤。pH4时最稳定，血浆中体外半衰期为20 min，体内15 min，80%与人体血浆蛋白结合［4］，24 h后血浆药物浓度几乎为0。熔点30～32℃，对光不稳定，在37℃ pH7.4的磷酸缓冲盐溶液（Phosphatebuffered saline，PBS）中半衰期为55 min，4 h后BCNU原型低于10%，在4℃PBS中降解缓慢，7 h后原型超过81%，鞘内注射进入脑内时，经水解作用分解，在脑组织匀浆中分解半衰期为110 min［3］。在甲醇中稳定，37℃ 24 h后仍超过92%［4］，活性代谢产物为氯乙基正碳离子［5］。

    同时，BCNU作为一种烷化剂，具有较多的结合位点，在局部给药达到较高浓度时容易发挥作用［6］。新近的研究还发现BCNU具有诱导细胞凋亡的作用［7］，同时还是细胞凋亡蛋白酶（caspase 3）抑制剂［8］。但是BCNU血浆半衰期短，代谢物由肾脏排泄，与肿瘤组织的接触时间短，研究证实，静脉滴注BCNU在脑组织内的穿透距离大约只有2 mm ［9］，往往不能达到有效的治疗目的。原发性脑恶性肿瘤复发率仍然比较高［10］。PLGA是由乳酸(LA)和羟基乙酸(GA)经缩聚反应形成的共聚物，在人体内生物降解，分解为H2O和CO2。具有良好生物兼容性的生物可降解性材料PLGA作为药物载体材料，已被美国FDA认可。Spenlehauer［11］在以溶剂挥发法制备氢化可的松微球时曾提出，当有机相含有高浓度药物时甲基纤维素对内乳相的稳定是必需的。本研究摸索实验条件时发现甲基纤维素浓度达到1%时微球形态不规则，可能是由于分子量和溶液粘度较高所致。以0.05%甲基纤维素和1%聚乙烯醇（聚合度124）作为水相乳化剂形成的微球形态呈圆形，但碎片较多，而以0.05%甲基纤维素和1.5%聚乙烯醇（聚合度1 750）作为水相乳化剂形成的微球形态呈圆形、表面光滑、分散较好。由于聚合度越大的聚乙烯醇聚合链越长，有机相微滴间的空间排斥力增加，从而避免了聚集现象，调整乳化剂聚乙烯醇的浓度，可以获得合适的微球粒径［12］。PVA分子量（以聚合度表示）越大，得到的微球粒径越小，经过比较我们选用聚合度为1 750的PVA。乳化剂主要以其亲疏水端以自我封闭形式吸附在不同两相之间，所以乳化剂浓度越高吸附微球表面越强烈，而且平均粒径降低。

    目前对空白微球稳定性的研究很多， Shameem等人［13］发现，微球对温度、压力的耐受力较差，故对其消毒灭菌应采用γ射线、环氧乙烷等非高温高压手段，同时制作工艺对其稳定性也有一定影响。有研究表明［14］通过溶剂挥发法制得的微球即使冷冻干燥后仍有水分残留。而此残留水分可降低玻璃转化温度(glass transition temperature,Tg)，从而使微球的热稳定性下降。还有学者改进制作工艺，制备双层微球，先用明胶包封药物制成核心，再于外层包裹PLA/PLGA，还可以加入各种赋形剂，制得的新微球与传统方法相比稳定性有所增强。

    由于BCNU的不稳定性，很容易产生这样一个问题，BCNU在微球中是否稳定？为此本研究在不同时间点从药物释放介质中取出PLGA微球，以去离子水冲洗药片表面以除去释放到表面的BCNU，冷冻干燥，以二氯甲烷溶解微球，HPLC测定微球内成分，并与空白PLGA微球及BCNU标准品比较。

    二氯甲烷溶解微球后BCNU峰与BCNU标准品峰形态一致，无杂质峰干扰，表明在本研究所采用的制备和保存条件下药物在微球内保持稳定状态，未发生分解，在模拟体内生理环境条件下（pH7.4，37℃ PBS溶液），药物自微球中缓慢释放，而未释放的药物仍保持原来的性状，未发生分解［15］，可以满足实验需要。Panagi［16］以125I标记BCNU方法制备PLGA缓释毫微粒，研究其稳定性，认为在体外和体内环境中稳定性良好。Brem［17］认为聚合体制备成微球制剂后可以防止内部的BCNU分解，当药物释放到微球表面时与肿瘤细胞直接接触。通过测定BCNU、PLGA、BCNU与PLGA物理混合物、空白PLGA微球及BCNUPLGA微球的玻璃转化温度，发现BCNUPLGA微球玻璃转化温度的改变仅仅是由于BCNU的存在，认为BCNU是PLGA的增塑剂，二者具有很强的可混合性，在4℃贮存个月后，微球的降解率为8.8%，并且微球内部的BCNU降解远远低于游离态的BCNU［18］。Lee等［4］将BCNU与PLGA混合后以模具压成片型，置入含9L胶质母细胞瘤细胞的培养基中，2～3 d更换培养基，发现可以持续抑制肿瘤细胞的增殖，而BCNU粉末只能在达到一定剂量后在3 d内抑制细胞增殖，认为BCNU持续以活性形式从PLGA聚合体中释放，也说明了BCNU在实验条件下在缓释微球中能够较长时间保持稳定性。

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