肝细胞核因子4α促进人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的研究

我们在前期添加细胞因子诱导人脐带间充质干细胞(HUMSCs)的条件下,后期转染肝细胞核因子4a(Hl}'F'4a)并检测诱导效果,寻找一种新的肝细胞种子来源.    一、材料与方法    1.材料:脐带由南京医科大学附属南京医院妇产科提供.    2.真核表达载体的构建:设计可以扩增HNF4.全长的引物,上游引物为5’-AGGATCCATGCGACTCTCC.AAAACCC-TCG-3',下游引物为5'-AGAATTCCC'I'-AGATAACTTCCTGCTTGGTG-3’.    3.HUMSCs的分离、培养:采用组织块培养法获取原代HUMSCs.细胞达80%左右融合时用0.25%胰酶消化,按1:3比例传代培养.    4.HUMSCs向肝细胞方向分化诱导方法:用含10岁L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),20,留LHGF的IMDM诱导9d,3--4d换液1次.然后采用阳离子脂质体法将质粒PCD\As.1}HVF4a转染到HI}l"C*中(实验组),对照组转染空质粒PCD\A3.15.实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR):取末诱导、诱导9d、诱导21d实验组和对照组细胞,相关操作按说明书进行6.免疫荧光法:取诱导21d的实验组和对照组细胞,相关操作按说明书进行.    7.统计学方法:结果以均数士标准差表示,应用SPSS16.0统计软件分析.    二、结果    1.形态学改变:转染HNF4.后5d,细胞开始聚集成团,12d后细胞由梭形变为圆形或类圆形对照组细胞仍为纤维母细胞样.    2.免疫荧光检测结果:结果发现实验组细胞白蛋白(ALB)表达显著,而甲胎蛋白(AFP)表达极弱.对照组细胞内ALB基本不表达,但是表达一定的AFP.    3.肝细胞特异性基因的表达:结果显示添加细胞因子上调了基因ALB,酪氨酸氨基转移酶(TAT)及葡萄糖6-磷酸酶(G-6P)的表达,对照组细胞继续培养12d后ALB,TAT、细胞色素P450酶3A4(CYP3A4)及G-6P表达量较前有所增高(P<0.05),而实验组同等基因的表达量显著增高(P<0.O5).    三、讨论    HNF4.是核激素受体超家族的一员,对于维持肝细胞表型、肝细胞分化以及肝细胞结构都发挥重要作用.本实验形态学结果显示,转染HNF4a的实验组与对照组比较,细胞更具有肝细胞样特征,呈圆形、类圆形或多边形,转染12d后尤为明显免疫荧光结果发现,转染12d后,ALB作为肝细胞分化成熟的标志物,在实验组细胞内有较强表达,而对照组红色荧光极弱.AFP作为肝细胞特异性标志,在幼稚肝细胞高表达,在成熟肝细胞低表达,两组细胞内,可见实验组AFP荧光信号极弱.因此,可以认为HNF4.促进了干细胞诱导分化并获得了成熟的表型.RT-qPCR结果显示,尽管转染空质粒12d后(对照组)特异性基因ALB,TAT,CYP3A4及G-6P的表达较前有所增高,但实验组与对照组的差异有统计学意义,表明HNF4.通过对基因的转录调控有效促进了HLMSCs向肝细胞的分化.    参考文献    Watt AJ,Ganison WD,Duncan SA. HNF4:a central regulator of hepatocyte differentiation and function[J].Hepatology,2003.1249-1253.    Parviz F,Matullo C,Garrison WD. Hepatocyte nuclear factor 4alpha controls the development of a hepatic epithelium and liver morphogenesis[J].Nature Genetics,2003.292-296.