25例肾病综合征患儿调节性T细胞水平变化及意义

　　儿童肾病综合征(nephroticsyndorme，NS)临床上表现多为水肿、大量蛋白尿、高脂血症、低清蛋白血症。它并不是一种独立性疾病，而是由于各种原因导致肾小球滤过膜的通透性增高，大量血浆蛋白从尿中丢失而引起的一组临床症候群。NS是临床常见的慢性迁延性疾病，易复发。儿童发病率高，多见于3～7岁儿童。近年研究表明，NS的发病与机体免疫功能有关。调节性T细胞(Treg)是一群具有免疫调节功能的细胞。但目前此类细胞在儿童NS中研究较少，本研究拟通过流式细胞术，检测肾病综合征患儿外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg的表达，以及淋巴细胞各亚群的数量，探讨其在NS的作用，为NS患儿的临床诊断和治疗提供一定依据。

1　资料与方法

1.1　一般资料　随机选择2012年至2013年在广州市妇女儿童医疗中心住院的初次确诊为NS患儿25例，各患儿之前均未经过治疗，其中，男性16名，女性9名;平均年龄6岁5个月。20例正常对照组为同期在门诊保健的健康儿童，其中，男性11名，女性9名;平均年龄3岁6个月。两组研究对象在年龄、性别构成方面比较差异无统计学意义(p>0.05)，具有可比性。

1.2　试剂与仪器　美国BD公司的抗人CD4-FITC抗体、抗人CD25-PE抗体，标记AlexaFluor647的抗人CD127抗体，以及BDMULTITESTTM试剂盒。流式细胞仪型号为BDFAC-SCalibur。

1.3　方法　Treg测定：NS组和正常对照组均空腹抽取外周静脉血2mL，用EDTA-K2抗凝。每个标本取抗凝全血100 μL，加入CD4、CD25、CD127荧光抗体各20μL，混匀后室温下避光反应15min。加入2mL溶血素，室温避光，溶血10min。然后各标本于1500r/min离心5min，去上清，加入2mL的PBS缓冲液，1500r/min离心5min，去上清后加入450μLPBS重悬，待上机。　　淋巴细胞各亚群测定：NS组和正常对照组均空腹抽取外周静脉血2mL，用EDTA-K2抗凝。两组儿童各取50μL抗凝全血分别加入置有相应20μL荧光抗体的专用的计数管中，混匀室温避光孵育15min，每管加入450μL溶血素，室温避光孵育15min后，待上机检测。

1.4　收集数据　用三色校准荧光微球和APC荧光标记微球制备定标液，通过FACSComp软件调整仪器前向角、侧向角，及其4个通道的电压和补偿。应用CELLQUEST软件获取10000个淋巴细胞进行分析，计算CD44+CD25+CD127-/lowTreg细胞占CD4+T细胞的比例。

1.5　统计学处理　采用SPSS18.0软件进行统计学分析，计量资料以X±s表示，组间比较采用狋检验，以p<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果　　外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞占CD4+T细胞的比例：NS组为(7.82±1.92)%，显著低于正常对照组(9.34 ±2.10)%，差异有统计学意义(p<0.05)。NS组患儿的CD3+CD4+辅助性T细胞绝对值、CD19+B细胞绝对值均明显低于正常对照组，差异有统计学意义(p<0.05);CD3+CD8+抑制性T细胞升高(p<0.05)，见图1、表1。

3讨　　论NS是由于肾小球滤过膜对血浆蛋白的通透性增高，大量血浆蛋白从尿中丢失而导致一系列病理生理改变的一种临床综合征[1]。迄今为止，其发病机理还是不十分明确，近年发现，NS的发病与机体免疫功能异常有关[2]。机体的免疫主要分为细胞免疫和体液免疫。T淋巴细胞是机体细胞免疫的基础，可分为CD3+CD4+辅助性T细胞(Th)和CD3+CD8+抑制性T细胞(Ts)两大类。Th的作用是增强免疫应答、活化细胞，增强其吞噬或杀伤功能。而Ts细胞则是识别存在于靶细胞表面上的MHCⅠ类分子与抗原结合的复合物，特异性直接杀伤靶细胞。作者在研究中发现，NS组患儿的Th细胞绝对值明显低于正常对照组，这与文献报道的相一致[3];且Ts细胞绝对值升高。结果提示NS患儿的Th和Ts细胞的比例失衡，引起了机体的细胞免疫反应，引发炎症介质的连锁释放，从而激活了炎症因子网络，导致肾小球屏障的破坏[4]。Th细胞按其分泌的细胞因子及功能不同，可分为Th1和Th2两大亚群。Th1细胞主要分泌白细胞介素2(IL-2)、干扰素(IFN)，以及肿瘤坏死因子β(TNF-β)等，其作用是介导与炎症有关的免疫应答，辅助抗体生成，参与细胞免疫。Th2细胞主要分泌白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)等，可刺激B细胞增殖并产生IgG和IgE抗体。在生理情况下，Th1/Th2细胞相互制约，相对平衡，以维持机体正常的免疫状态。当某一亚群细胞数量或功能发生变化时，这个平衡将会被打破。Bagga等[5]研究发现，在NS患儿肾脏组织中Th1和Th2细胞分泌的细胞因子高度表达，肾小球的免疫复合物沉积，及其所致损伤与这些细胞因子高表达密切相关。提示T细胞参与了肾脏组织的免疫损伤[6]。CD19+是成熟B淋巴细胞的特异性标志，是检测B淋巴细胞最好的标志物。在研究中发现，NS患儿CD19+的B细胞绝对值明显低于对照组，与Kemper等[7]的研究结果一致，没有接受激素治疗的NS患儿CD19+的B细胞均低于正常对照组。Treg是一类具有免疫抑制特性的T淋巴细胞亚群，在机体免疫应答调节中发挥重要作用[8]。早在1995年，日本学者Sakaguchi等[9]发现，将小鼠外周血中CD4+CD25+细胞去除后，会导致小鼠自发产生多种自身免疫性疾病，而重新回输这些细胞后则阻止了疾病的发生。因此将此群细胞命名为CD4+CD25+Treg细胞。另外，在健康人中，近10%的外周血CD4+T细胞均表达IL-2受体A链(即CD25)。故CD25成为Treg的一种标志物。但由于CD25既是调节性T细胞又是活化T细胞的标志物，所以不能单纯依靠CD25将二者区分开来。在后续的研究中发现了Treg的转录因子Foxp3，它是目前最为特异的Treg标记物。然而Foxp3为胞内蛋白，需要进行固定、穿孔、染色，操作繁琐，不利于分选和纯化，在临床和科研中推广比较难[10]。近年研究表明，Treg表面CD127的低表达与胞质内Foxp3的高表达具有良好的相关性[11]。故CD4+CD25+CD127-/low成为了Treg的新的标志。作者通过流式细胞术检测了NS组患儿和正常对照组的外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞占CD4+T细胞的比例，结果发现NS组患儿的CD4+CD25+CD127-/lowTreg表达明显低于正常对照组。提示Treg细胞数目减少导致其功能失调，从而使机体免疫抑制功能受损。Treg细胞主要是通过直接细胞接触机制或分泌调节性细胞因子机制来主动抑制自身免疫细胞的活化，在维持机体的平衡方面有重要作用。Treg细胞可通过细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、转化生长因子-β(TGF-β)以及糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)等直接与肾脏组织上的相应受体结合，并抑制靶细胞上IL-2Rα链的表达，降低靶细胞对IL-2的反应性。由于NS患儿CD4+CD25+CD127-/lowTreg比例的下降，使机体对效应T细胞的抑制作用减弱，不能有效防御自身免疫反应的发生。同时，由于NS患儿体内的CD4+CD25+CD127-/lowTreg水平降低，其分泌的细胞因子也会明显降低。Treg细胞活化后会产生细胞因子IL-10，TGF-β [12]。在NS早期，Treg分泌的IL-10，TGF-β的水平降低使其通过分泌细胞因子而对Th1/Th2细胞亚群的平衡调节能力也相应地降低，导致Th1/Th2失衡，进而炎症反应失控导致自身免疫损伤。由于上述多种因素，使机体针对自身肾小球固有抗原和种植抗原的病理性免疫应答的调节能力下降，促进NS的发生与发展。综上所述，NS患儿外周血中淋巴细胞免疫功能的紊乱，特别是CD4+CD25+CD127-/lowTreg水平降低，提示其参与了疾病的发生和发展，为今后进一步研究CD4+CD25+CD127-/lowTreg在NS的发病机制，制备单克隆抗体回输体内的治疗方案等方面提供了新思路及新方法，也为NS的临床诊治提供一定的实验室依据。

参考文献

[1]胡亚美.诸福棠实用儿科学[M].7版.北京：人民卫生出版社，2005：1641-1647.

[2]梁亚浩，刘光陵.儿童肾病综合征免疫功能状态的研究进展[J].中国全科医学，2011，14(24)：2810-2812.

[3]丁楠，郝丽，黎淮，等.原发性肾病综合征患者免疫指标变化的临床意义探讨[J].中国免疫学杂志，2011，27(4)：356-359，381.

[4]何文兵，刘光陵.原发性肾病综合征的免疫致病机制探讨[J].中国全科医学，2010，13(30)：3461-3463.

[5]BaggaA，MantanM.Nephroticsyndromeinchildren[J].IndianJMedRes，2005，122(1)13-28.

[6]毛晓燕，莫樱，蒋小云.激素敏感型肾病综合征儿童外周血T，B淋巴细胞亚群的研究[J].中山大学学报：医学科学版，2012，33(4).504-507，511.

[7]KemperMJ，ZepfK，KlaassenI，etal.Changesoflymphocytepopulationsinpediatricsteroidsensitivenephroticsyndromearemorepronouncedinremissionthaninrelapse[J].AmJNephrol，2005，25(2)：132-137.

[8]StephensLA，BarclayAN，MasonD.PhenotypiccharacterizationofregulatoryCD4+CD25+Tcellsinrats[J].IntImmunol，2004，16(2)：365-375.

[9]SakaguchiS，SakaguchiN，AsanoM，etal.ImmunologicselftolerancemaintainedbyactivatedTcellsexpressingIL2receptoralphachains(CD25).Breakdownofasinglemechanismofselftolerancecausesvariousautoimmunediseases[J].JImmunol，1995，155(3)：1151-1164.

[10]BanhamAH.CellsurfaceIL7receptorexpressionfacilitatesthepurificationofFoxP3+regulatoryTcells[J].TrendsImmunol，2006，27(12)：541-544.

[11]LiuW，PutnamAL，XuZ，etal.CD127expressioninverselycorrelateswithFoxP3andsuppressivefunctionofhumanCD4+Tregcells[J].JExpMed，2006，203(7)：1701-1711.

[12]RedutaT，StasiakBarmutaA，LaudańskaH.CD4+CD25+andCD4+CD25highregulatoryTcellsindisseminatedandlocalizedformsofallergiccontactdermatitis：relationtospecificcytokines[J].FoliaHistochemCytobiol，2011，49(2)：255-254.

(收稿日期：2013-10-16)