紫外分光光度法检测血清草甘膦中毒方法的建立和应用
发表时间:2014-05-16 浏览次数:1437次
草甘膦(glyphosate)是由美国孟山都公司开发的除草剂,又称镇草宁、农达、草干膦、膦甘酸。草甘膦除草剂有草甘膦铵盐和草甘膦异丙胺盐。市售草甘膦多为草甘膦异丙铵盐,因具有广谱、高效、低毒、安全等优点而被广泛应用。虽然为低毒除草剂,是相对百草枯而言,口服85mL草甘膦就会引起严重的中毒效应[1].草甘膦急性中毒基本上是由口服所致,国外和我国均有较多经口服中毒的报道[2].但由于草甘膦水溶性高,分子结构中无紫外吸收基团,且极难溶于有机溶剂,导致血液中草甘膦的测定方法很难建立。文献[3.6]报道关于草甘膦的检测方法有气相色谱法、高效液相色谱法、流动注射化学发光检测法、亚硝基化单扫描示波极谱法等,但多是取材和测定废水中的草甘膦,以鉴定水质情况为目的。中毒患者血液中草甘膦如何测定尚未见有报道。本文参考文献[3.7],探讨建立了中毒患者血液中草甘膦异丙胺盐测定方法,该方法简更快速、结果准确,可以作为临床草甘膦异丙胺盐中毒急救的指标。 1 资料与方法 1.1一般资料健康人血清和草甘膦中毒患者血清均由本院提供。 1.2检测原理草甘膦是仲胺化合物,氨基上的氢原子可被亚硝基取代而变成亚硝基磷甘酸。该化合物在波长243nm有吸收峰,一定浓度的草甘膦与其吸光度成正比。 1.3仪器与试剂UV.2600双光束紫外/可见分光光度计、50μL微量比色池为上海天美科学仪器有限公司产品,LG16.B高速离心机为北京雷勃尔离心机有限公司产品,SK.1型快速混匀器为常州国华电器有限公司产品。草甘膦标准品(纯度为99.0%)由美国Aldrich公司提供,高氯酸、甲醇、三氯醋酸、硫酸、亚硝酸钠均为分析纯。试剂配制:10%高氯酸甲醇溶液,200g/L三氯醋酸,10mol/L硫酸,10g/L亚硝酸钠(新鲜配制),250g/L溴化钾。 1.4方法 1.4.1检测波长的确定配制100μg/mL的草甘膦标准贮备液。然后再用蒸馏水稀释草甘膦贮备液,使草甘膦浓度为50、20、10、0.0μg/mL的标准应用液。各不同浓度标准液0.5mL于10mL玻璃试管中,进行亚硝基化反应,即加蒸馏水1.5mL混匀,加10mol/L硫酸0.2mL,250g/L溴化钾0.2mL,10g/L亚硝酸钠(新鲜配制)0.2mL,立即混匀盖塞,室温放置30min.以空白做基线测量,分别对草甘膦标准应用液进行扫描。 1.4.2草甘膦浓度的测定取2支带盖塑料试管标注V管和B管,V管加患者血清0.5mL,B管加健康人混合血清0.5mL,分别加10%高氯酸甲醇溶液0.2mL,用SK.1型快速混匀器充分震荡,静置2min,以10000r/min高速离心5min,取上清液0.4mL分别于玻璃试管中,加蒸馏水1.5mL混匀,加10mol/L硫酸0.2mL,250g/L溴化钾0.2mL,10g/L亚硝酸钠(新鲜配制)0.2mL,立即混匀盖塞,室温放置30min.设定扫描波长范围为200~400nm,取血清空白液50μL做基线测量,然后扫描V管亚硝化液。草甘膦最大吸收峰在(243±1)nm.根据(243±1)nm处的最大吸收峰进行定性,查标准曲线或回归方程求出患者血清中草甘膦浓度。 1.4.3空白试验取健康人混合血清0.5mL,分别加入3个带塞塑料试管中,按1.4.2方法沉淀蛋白,上清液进行亚硝基化。用其中1份硝化液50μL做基线扫描,然后扫描其他2份空白硝化液。 1.4.4线性范围与检出限精确配制100μg/mL的草甘膦标准贮备液。取配制好的100μg/mL的草甘膦标准贮备液,用健康人混合血清逐级稀释为0.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μg/mL的草甘膦工作应用液,分别取0.5mL置于7个带盖塑料试管中,分别加10%高氯酸甲醇溶液0.2mL,用SK.1型快速混匀器充分震荡,静置2min,以10000r/min高速离心5min,取上清液按1.4.2方法进行亚硝基化。设定扫描波长范围为200~400nm,取血清空白液50μL做基线测量,然后扫描不同浓度的草甘膦标准液,草甘膦最大吸收峰在(243±1)nm.按上述操作方法做5次平行试验,根据在(243±1)nm测定的平均吸光度值(犊)对草甘膦质量浓度(犡)进行回归分析。 1.4.5回收率试验采用加入回收法,取健康人混合血清配制浓度为15.0、20.0、25.0、35.0μg/mL草甘膦血清样品,各取0.5mL于带盖塑料试管中,并取空白血清0.5mL作对照,按1.4.2样品测定方法进行扫描。 1.4.6精密度试验取健康人混合血清20.0mL,分别配制浓度为0.00、10.0、20.0、30.0μg/mL草甘膦血清样品,分别取0.5mL于5支带盖塑料试管中。其他操作按样品测定部分进行。在同一日不同时间及不同日间按上述方法测定草甘膦浓度(状=5),计算日内、日间相对标准偏差(犚犁犇)。 2 结果 2.1空白试验结果健康人血清在200~400nm无吸收峰。 2.2线性范围及检出限线性回归方程:犊=0.01738犡+0.0363,相关系数(r)=0.9998,线性范围为10.0~60.0μg/mL,最低检出限为5.0μg/mL. 2.3回收试验结果回收率为85.5%~102.4%,犚犁犇为3.5%~4.9%,见表1. 2.4精密度试验结果日内、日间犚犁犇分别为3.79%~5.10%和3.88%~4.55%,最低检出浓度5.0μg/mL.见表2. 3 讨论 百草枯中毒引发的高病死率已经引起农业部、卫生部、公安部门的高度重视,用草甘膦替代百草枯除草剂成为必然。近年来草甘膦作为低毒除草剂广泛应用于农林畜牧业,临床上草甘膦中毒有逐年增多的趋势。草甘膦不易被胃肠吸收,不经代谢很快经肾、胃肠道排出,在体内不蓄积,所以血液透析可以尽快清除血液中的草甘膦,应及早应用[8].当草甘膦浓度在10μg/mL以下时,临床中毒特征并不明显,当草甘膦浓度达到20.0μg/mL以上时,则出现明显的中毒症状,如恶心呕吐、咳嗽、胸闷、呼吸困难、抽搐、昏迷等。为了配合临床诊断、救治草甘膦中毒患者,建立患者血液草甘膦测定方法非常必要。市售草甘膦一般为草甘膦异丙铵盐,水溶性高,分子结构中无紫外吸收基团,且极难溶于有机溶剂,导致血液中草甘膦的测定方法很难建立。作者曾试图直接用二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂萃取血液中草甘膦,用气相色谱法、高效液相色谱法、紫外分光光度法测定都没有成功。 草甘膦化学结构中氨基上的氢原子可被亚硝基取代而变成亚硝基磷甘酸,该化合物在波长243nm有吸收峰,因此作者想到了对血液中草甘膦进行硝基衍生化后进行测定,那么选择血清蛋白沉淀剂成为关键。作者选择10%高氯酸甲醇溶液与20%三氯醋酸溶液做血清蛋白沉淀剂进行比较,发现含有草甘膦的血清经10%高氯酸甲醇溶液沉淀后的上清液经亚硝基化反应,回收率达85.5%~102.4%,草甘膦最大吸收峰为(243±1)nm,与草甘膦标准水溶液亚硝基衍生化反应相吻合,而20%三氯醋酸沉淀蛋白上清液亚硝基化反应,草甘膦结果不稳定且最大吸收峰不在243nm.本研究表明,取患者0.5mL血清加10%高氯酸甲醇溶液0.2mL沉淀血清蛋白,取上清液进行亚硝基化反应,草甘膦最大吸收峰为(243±1)nm,灵敏度和准确度完全能够达到临床要求。草甘膦中毒患者生物样品检测一直是个难题,作者用高氯酸甲醇溶液沉淀血清蛋白,并将草甘膦进行亚硝基化反应,使草甘膦有了最大吸收峰能够用紫外分光光度法检测,其测定方法简便快速,灵敏度较高,结果准确。 参考文献 [1]许明正,刘全有,龙继贤,等。急性草甘膦中毒13例分析[J].中华危重医学杂志:电子版,2009,2(1):39. [2]BradberrySM,ProudfootAT,ValeJA.Glyphosate[3]汪海萍,邵燕,王志良,等。分光光度法测定废水中草甘膦的探讨[J].环境监测管理与技术,2012,24(3):56.57. [4]范顺利,吕超,高建磊。反相流动注射化学发光测定草甘膦[J].理化检验:化学分册,2001,37(7):289.291. [5]孙楠,胡宝祥,莫为民。草甘膦的亚硝基化单扫描示波极谱法测定及应用[J].药,2007,9(1):609.611. [6]薛铭华,杨万兴。N.亚硝基衍生化的紫外分光光度法测定草甘膦[J].农药,1982,3(2):31.32. [7]陈姿如,吴名,陈礼明,等。血清中佐匹克隆测定的紫外分光光度法[J].中华劳动卫生职业病杂志,2013,31(5):544.545. [8]杨水莲,匡兴亚,姚峰,等。急性草甘膦中毒4例病理报道[J].中华职业医学,2008,35(2):135.137. (收稿日期:2013.12.16)