内质网相关的凋亡途径在高三尖杉酯碱诱导MUTZ-1细胞凋亡过程中的作用

　　作者：胡洁　何冬花　高良　杨春虎,蔡真　　作者单位：浙江大学医学院附属第一医院血液科骨髓移植中心,杭州 310003;浙江大学医学院生物电磁学省重点实验室,杭州 310009

　　【摘要】本研究探讨高三尖杉酯碱 ( Homoharringtonine, HHT )诱导人MDS细胞株MUTZ-1细胞凋亡的作用机制。 以HHT处理骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ-1(MDS-RAEB), 用流式细胞术检测细胞凋亡率，用激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度和线粒体膜电位变化，应用RT-PCR检测HHT处理前后与内质网应激有关的基因(CHOP,BIP,XBP1)的表达情况。 结果表明： 0.05 μg/ml HHT作用MUTZ-1细胞的凋亡率随着时间的延长而增加，其差异具有统计学意义(P<0.01);激光共聚焦结果显示， 0.05 μg/ml HHT作用后4小时胞浆内Ca2+浓度增高，12小时达高峰，其后开始下降; HHT作用后线粒体膜电位持续下降; CHOP以及 BIP,XBP1基因表达增强，12小时达到高峰，其后开始下降。 结论: HHT可以诱导MDS细胞株MUTZ-1凋亡，内质网相关的凋亡途径在其中发挥了重要的作用。

　　【关键词】 高三尖杉酯碱; MDS细胞株MUTZ-1 ; 细胞凋亡; 内质网应激

　　Role of Endoplasmic Reticulum Pathway in Apoptosis of MDS Cells Induced by Homoharringtonine　HU Jie, HE Dong-Hua, GAO Liang, YANG Chun-Hu， CAI Zhen　Department of Hematology, Bone Marrow Transplantation Center, The First Affiliated Hospital, Medical College of Zhejiang University, Hangzhou 310003, China; 1Zhejiang Provincial Key Laboratory of Bioelectromagnetics,Medical College of Zhejiang University, Hangzhou 310009, China

　　AbstractThe study was aimed to investigate the apoptotic mechanism of homoharringtonine (HHT) on MDS cell line ( MUTZ-1 cells ). The apoptosis of MUTZ-1 cells induced by HHT was measured by flow cytometry. The concentration of cystosolic calcium was measured with the mitochondrial membrane potential by confocal . The mRNA expression level of CHOP, BIP and XBP1 were detected by semi-quantitative RT-PCR. The results showed that after exposure of MUTZ-1 to HHT for different hours , the percentage of apoptotic MUTZ-1 cells increased in a time dependent manner. Typical apoptotic cells and release of Ca2+ from the cytosolic Ca2+ storage and the loss of mitochondrial membrane potential were observed. RT-PCR analysis revealed that mRNAs for endoplasmic reticulum (ER) stress-associated proapoptotic factor CHOP and ER chaperone BIP, XBP1 markedly increased at 4 hours after treatinent with 0.05 μg/ml HHT and reached the top level at 12 hours, and then decreased. It is concluded that HHT not only inhibits MUTZ-1 growth but also induces MUTZ-1 apoptosis. The HHT-induced MUTZ-1 cell death is likely mediated by the ER stress pathway.

　　Key wordshomoharringtonine; MUTZ-1 cell; apoptosis; ER stress

　　骨髓增生异常综合征(MDS)是一组异质性的造血干细胞疾病，病理生理学改变为造血前体细胞成熟障碍和过度增殖，易于向白血病转化[1,2], 其发病和治疗机制是目前临床研究的热点。高三尖杉酯碱(HHT)是我国自主研制成功的高效抗白血病药物[3]，临床上用来治疗MDS取得一定的疗效，本研究组前期工作表明HHT主要通过诱导细胞凋亡发挥抗白血病作用[4], 我们进一步研究表明，在此过程中内质网发挥了重要的作用。

　　材料和方法

　　主要试剂

　　HHT(1 mg/ ml) 购自杭州民生药厂，在使用之前用RPMI 1640(RPMI 1640干粉购自Gibco公司) 稀释至所需浓度。Fluo3/AM 购自美国Biotum公司，JC-1购自Sigma公司，Annexin-V/PI , Mito-tracker, ER-tracker购自Molecular probe公司， 鼠抗人荧光二抗购自Cell signal公司。

　　细胞培养

　　人MDS 细胞系MUTZ-1引自德国Brauschweig 细胞中心[5] ;在5 % CO2 、37 ℃条件下,于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中培养传代, 实验用细胞均处于对数生长期。

　　细胞凋亡的测定

　　采用流式细胞术进行Annexin V/PI双标记测定。取经HHT处理后的各组细胞，调整浓度为2.0×105/ml，加入 Annexin V/FITC 5 μl 和 PI 0.5 ml，室温避光30分钟，用 PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测。

　　细胞内钙浓度变化的共聚焦激光扫描显微镜检测[6]

　　收集处理后的各组细胞，用新鲜培养液调整细胞密度为2×106/ml，加入fluo3/AM(终浓度为5 μmol/L), 37℃下避光温育35分钟，Hanks液洗涤2次。用Laica-TCSSP激光共聚焦扫描显微镜对细胞内钙进行检测，激发波长为488 nm,发射光为527 nm。

　　线粒体膜电势变化的共聚焦激光扫描显微镜检测[7]

　　JC-1 为一种特异性的阳离子荧光染料,可定位在线粒体膜上,其激发光为490 nm,单体发射光为527 nm,多聚体发射光为590 nm,其聚集程度与膜电位成正比。当线粒体膜电位增高时,红色荧光增强,红色荧光和绿色荧光的比值可代表膜电位的高低。收集不同处理组的细胞, 用新鲜培养液调整细胞密度为2×106/ml，然后与10 μg/ml JC-1 37℃负载30分钟, PBS洗2次后用共聚焦显微镜检测。以红色荧光值与绿色荧光值的比值的大小来表示膜电位的高低。

　　凋亡前因子CHOP基因、内质网未折叠蛋白质基因BIP,XBP1 mRNA表达水平的RT-PCR检测

　　引物： CHOP(357 bp)上游5'-AGTCATTGCCTTTC-TCTTCG-3'， 下游5'-GGTGCAGATTCACCATTCGG-3'; BIP(231 bp)上游 5'-ATCACGCCGTCCTATGTCGC-3'; 下游5'-TCTCCCCCTCCCTCTTATCC-3'; XBP1(441 bp)上游 5'-CCTTGTAGTTGAGAACCAGG-3'， 下游5'-GGGGCTTGGTATATATGTGG-3'; β-actin(619 bp)上游: 5'-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3， 下游: 5'-GTCACG CAC GATTTCCCGCT-3'。反应条件： 94℃ 3分钟;94℃ 30秒; 58℃ 30秒; 72℃ 45分钟，共30个循环; 72℃延伸10分钟。 PCR产物用1.5%的凝胶电泳，紫外灯下观察并照相。

　　统计学处理

　　数据用±SD表示, 用SPSS 12.0分析， P<0.05表示有统计学意义，P<0.01表示有显著意义。

　　结果

　　细胞凋亡流式细胞仪检测结果

　　0.05 μg/ml HHT作用后0，6,12及24小时MUTZ-1细胞的凋亡率分别为(0.63±0.59)%， (5.07±1.38)%，(10.21±5.79)%，(22.52±6.55)%，凋亡率随着时间的延长而增高，差异具有统计学意义(P<0.01)(图1A、B)。

　　细胞内钙离子浓度的改变

　　0.05 μg/ml HHT作用4小时后, MUTZ-1培养细胞内绿色荧光强度即明显增加， 12小时达高峰，其后开始下降 。统计学分析资料表明, 加入HHT后的MUTZ-1培养细胞内的[Ca2+ ] i与空白对照组相比有显著性差异(P <0.01)(表1，图2)。Table 1. Fluo-3/AM fluorescence of MUTZ-1 cells treated with HHT (略)

　　细胞膜电位的变化

　　正常MUTZ-1细胞的表面大多呈均匀的橙红色,显示绿色荧光的细胞较少;而经过HHT处理的细胞胞体增大、绿色荧光增强,表明细胞受到损伤其线粒体膜电位有所下降。 HHT处理后细胞红、绿荧光值的比值和正常对照组比较4小时后开始下降，8小时后较为明显，48小时后细胞凋亡测不出。统计学分析表明0.05 μg/ml HHT作用8小时后的MUTZ-1培养细胞与空白对照组相比差异具有显著性意义(P< 0.01) (表2，图3)。Table 2. Dynamic change of mitochondrial membrane potential (Δψm) in MUTZ-1 cells treated with HHT (略)

　　凋亡相关基因RT-PCR结果

　　MUTZ-1细胞静息状态下内质网应激相关基因CHOP基因不表达，BIP, XBP-1基因少量表达，0.050 μg/ml HHT作用4小时后即开始表达增强，12小时达高峰，24小时表达量下降，48小时测不出，各组与空白对照组相比较差异具有统计学意义(P<0.01)(图4A、B)。

　　讨论

　　高三尖杉酯碱(HHT)是我国自主研制成功的高效抗白血病药物，主要通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用,其确切机制是目前研究的热点。本实验应用流式细胞术检测MUTZ-1细胞凋亡的发生，且HHT引起MUTZ-1细胞凋亡是时间依赖性的。我们进一步研究发现内质网在其凋亡过程中也发挥了重要的作用。内质网相关细胞凋亡是不同于受体介导(TNFR,Fas)或线粒体介导DNA损伤的另一种新的细胞凋亡途径。内质网与细胞凋亡相联系表现在两个方面;一是内质网对Ca2+的调控，二是内质网应激反应。 大量实验表明，很多细胞在凋亡早期会出现胞质内Ca2+浓度迅速持续的升高，这种浓度升高来源于细胞外Ca2+的内流和胞内钙库(如内质网)的释放。相对高浓度的Ca2+一方面可以激活胞质中的钙依赖性蛋白酶(如钙蛋白酶calpain)，另一方面可以作用于线粒体，影响其通透性的改变，进而促进凋亡[9，10]。 本研究以Fluo-3/AM为指示剂,采用激光扫描共聚焦显微镜法测定细胞内游离Ca2+ ,结果发现人MUTZ-1细胞受HHT作用后4小时细胞内钙荧光强度开始增加,8小时后增高更为显著,12小时达高峰，其后开始下降，但仍高于静息状态，表明HHT作用后出现钙超载。本研究同时也以JC-1作为指示剂，用激光扫描共聚焦显微镜法测定用药前后细胞线粒体膜电位的改变，结果显示用药后，线粒体膜电位持续下降。因此我们推测HHT作用于MUTZ-1细胞，引起MUTZ-1细胞内游离钙离子的早期升高，但最终导致细胞内钙库耗竭，线粒体膜电位的持续下降，细胞凋亡发生。 内质网内错误折叠蛋白质聚集就会导致内质网分子伴侣基因表达激活，当未折叠蛋白质过度聚集变成有毒性时就会触发细胞凋亡。信号主要通过caspase -12下传。钙蛋白激酶CHOP(C/EBP homologus protein)基因也参与内质网应激反应诱导细胞凋亡[11-12]。我们的结果表明，0.05 μg/ml HHT能诱导CHOP基因和内质网分子伴侣基因BIP,XBP-1表达增加， 表明HHT作用于MUTZ-1后诱导了内质网应激持续发生，从而引起MUTZ-1细胞凋亡的发生。总之，本实验结果表明，HHT可以诱导MDS细胞株MUTZ-1凋亡， 内质网相关的凋亡途径在其中发挥了重要的作用，但线粒体相关的凋亡途径也与之关系密切。进一步研究两者的关系将是我们下一步所要研究的课题。

　　【参考文献】

　　1 Look AT. Molecular Pathogenesis of MDS. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program), 2005;156-160

　　2 O'Brien S, Kantarjian H, Koller C, et al. Sequential homoharringtonine and interferon-alpha in the treatment of early chronic phase chronic myelogenous leukemia. Blood, 1999; 93: 4149-4153

　　3 Zhou DC, Zittoun R, Marie JP. Homoharringtonine: an effective new natural product in cancer chemotherapy. Bull Cancer, 1995; 82:987-995

　　4 Cai Z, Bao HY, Lin MF. Correlation between survivin mRNA expression and homoharringtonine induced apoptosis of malignant hematopoietic cells. Chin Med J (Engl), 2005;118:548-554

　　5 Steube KG, Gignac SM, Hu ZB, et al. In vitro culture studies of childhood myelodysplastic syndrome： establishment of the cell line MUTZ-1. Leuk Lymphoma, 1997; 25:345-363

　　6 Pettit EJ, Hallett MB. Early Ca2+ signalling events in neutrophils detected by rapid confocal laser scanning. Biochem J, 1995;310 ( Pt 2):445-448

　　7 Ogbourne SM, Suhrbier A, Jones B, et al. Antitumor activity of 3-ingenyl angelate: plasma membrane and mitochondrial disruption and necrotic cell death. Cancer Res, 2004; 64 :2833-2839

　　8 Hitomi J, Katayama T, Eguchi Y, et al. Involvement of caspase-4 in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis and Abeta-induced cell death. J Cell Biol, 2004;165:347-356

　　9 Kwan HY, Leung PC, Huang Y, et al . Depletion of intracellular Ca2+ stores sensitizes the flow-induced Ca2+ influx in rat endothelial cells. Circ Res, 2003; 92:286-292

　　10 Shen ZY, Shen WY, Chen MH, et al. Nitric oxide and calcium ions in apoptotic esophageal carcinoma cells induced by arsenite. World J Gastroenterol, 2002; 8:40-43

　　11 Oyadomari S, Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death Differ, 2004; 11:381-389

　　12 Sun S, Han J, Ralph WM Jr, et al. Endoplasmic reticulum stress as a correlate of cytotoxicity in human tumor cells exposed to diindolylmethane in vitro. Cell Stress Chaperones, 2004; 9:76-87