TGF-β信号在造血发育中的作用

　　作者：兰雨,杨晓　　作者单位：军事医学科学院生物工程研究所发育与疾病遗传学研究室，北京 100071

　　【摘要】造血发育包括胚胎期的造血发生和成体造血稳态的维持。作为重要模式生物的小鼠为研究造血发育提供了非常好的模型。转化生长因子-β(TGF-β)作为造血调控的重要因子受到越来越多的重视。系统地研究TGF-β信号在哺乳动物个体发育的生理环境下对造血发生和发育的作用，随着基因剔除技术的建立和成熟而成为可能。本文就近年来以小鼠为研究对象，应用基因剔除、显性负效转基因等手段构建的TGF-β信号分子缺失个体的造血相关表型等研究作一综述，以进一步阐明TGF-β信号在造血发生和发育中的作用及可能机制。

　　【关键词】 转化生长因子-β; 基因剔除; 造血; 造血发育

　　TGF-β Signaling during Hematopoietic Development —— Review　LAN Yu, YANG Xiao　Department of Genetics of Development and Diseases, Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China

　　Abstract Hematopoietic development is characterized by the dynamic generation of hematopoietic stem/progenitor cells during embryogenesis, and afterward, the maintaining of hematopoietic homeostasis in adult. Mouse model has been appreciated valuable for dissecting the regulatory mechanisms of hematopoietic development. As an important cytokine playing pivotal and versatile roles in the regulation of hematopoiesis, transforming growth factor-β(TGF-β) attracts more and more attention. In particular, gene targeting by homologous recombination provides a key means for systematic evaluation of how TGF-β signaling is involved in hematopoiesis under physiological conditions. To further illustrate the functions and possible mechanisms of TGF-β in hematopoietic development, hematopoietic phenotypes of targeted mutations and/or dominant negative transgenes of molecules within the TGF-β signaling pathway are categorized and discussed in this review.

　　Key words TGF-β; gene targeting; hematopoiesis; hematopoietic development

　　从发育学角度，造血包括胚胎期造血的发生和成体造血稳态的维持。作为重要模式生物的小鼠为研究造血发育提供了非常好的模型。小鼠造血发生同人类一样，包括胚外造血和胚内造血，二者在终末细胞的形态学、分子调控机制上均有很大不同。前者又称原始造血，发生于小鼠胚胎7.0-7.5天的胚外中胚层的卵黄囊血岛。造血和血管内皮的共同前体——成血-血管细胞分化为造血前体细胞，主要产生原始红细胞。原始造血仅维持较短的时间。胚胎8.5-9.0天在主动腺-生殖腺-中肾(AGM)区发生了胚内造血(又称定向造血、永久造血)，产生造血干细胞(HSC)，同时胚胎内的循环建立。随后AGM区的HSC迁移至胎肝进行造血活动。胚胎中期后，永久造血完全取代了原始造血。出生后骨髓代替胎肝成为成体造血活动的主要场所[1]。造血稳态的维持是指在成体的造血活动中，通过对造血干细胞增殖分化的精确调控，以保持干细胞池的稳定，并且产生数量功能正常的成熟血细胞。TGF-β信号分子超家族含有至少45个已知成员，是一组结构相似、功能重叠的多效性细胞因子。其中TGF-β在哺乳动物中有TGF-β1、2、3 三种异构体，而以TGF-β1分布最广，活性最强，对其了解也最为深入[2, 3]。TGF-β作为造血调控的重要因子受到越来越多的重视。TGF-β信号传导阻断可能是人类多种类型白血病的发病机制之一，而病理性的TGF-β过表达与骨髓纤维化和造血干/祖细胞数量减少有关，提示TGF-β对人类造血干/祖细胞的静息、增殖和分化发挥重要的调控作用。大量的体外研究进一步表明，尽管TGF-β可对造血细胞的增殖、分化、凋亡发挥正性或负性的调控，其效应也随细胞的系列、分化阶段、甚至培养条件的差异而有不同，但是TGF-β主要是作为负向调节因子在造血干/祖细胞水平发挥生长抑制效应[4]。系统地研究TGF-β信号在哺乳动物个体发育的生理环境下对造血发生和发育的作用，随着基因剔除技术的建立和成熟而成为可能[5]。本文以作为重要模式生物之一的小鼠为研究对象，就近年来应用基因剔除、显性负效转基因等手段构建的TGF-β信号分子缺失个体的造血相关表型做一综述，以期阐明TGF-β信号在造血发生和发育中的作用及可能机制。

　　TGF-β信号传导通路

　　TGF-β通过跨膜的I型(TβRI)和II型受体(TβRII)传导信号。TGF-β首先与TβRII结合，随后结合并磷酸化TβRI。继而胞内的信号分子Smads作为跨膜受体的底物，继续传递信号。Smads根据其功能不同分为3类： 第一类——受体激活型Smads(R-Smads)，可直接被TβRI磷酸化激活，再与第二类——通用型Smads(Co-Smads)结合，形成异源二聚体。R-Smads/Co-Smads复合物入核，发挥针对靶基因的转录调控作用。第三类——抑制型Smads(I-Smads)，可阻断R-Smads和Co-Smads的相互作用，并参与TGF-β信号的负反馈调节。对于哺乳动物的TGF-β信号，R-Smads主要包括Smad2和Smad3，Co-Smads包括Smad4，I-Smads包括Smad6和Smad7[2，3]。研究TGF-β信号分子在造血发育中的作用，主要针对3类靶分子进行基因干预：TGF-β(使内源性分泌缺失)、TβR(使细胞对TGF-β的反应性消失)和胞内信号分子Smads(使信号传递受阻)。

　　TGF-β对小鼠胚胎造血发育的作用

　　用原位杂交的方法，最早可在小鼠胚胎7.5天的胚外卵黄囊的血岛检测到TGF-β1的表达。在胚胎发育的后期，胎肝的血细胞和早期内皮细胞均表达TGF-β1的RNA。这提示TGF-β1在造血发育、血管发生和血管生成中可能发挥调控功能[6]。1995年，Dickson等[7]应用TGF-β1基因剔除小鼠模型发现，TGF-β1是卵黄囊造血和内皮分化所必需的。50%的TGF-β1完全基因剔除小鼠和25%的杂合子死于胚胎发育第10.5天。原发缺陷局限于胚外卵黄囊的血管和造血系统：内皮分化缺陷导致血管发生障碍;造血缺陷导致卵黄囊内红系细胞数量减少，而红系细胞中的血红蛋白含量正常。小鼠胚胎由于继发的严重发育停滞而死亡。这些表型表明TGF-β1可同时调控胚胎造血发生和血管发生两个系统，它是内皮分化和卵黄囊造血的重要正向调节因子。同TGF-β1基因剔除小鼠的表型一样，TβRII基因剔除小鼠也是由于卵黄囊血管发生和造血的缺陷而死于胚胎中期[8]。上述结果提示，TGF-β可能是卵黄囊造血的重要调节因子，但实验结论均基于体内原位检测的结果，不能排除造血为继发性缺陷的可能。2001年Larsson等[9]报道，TβRI基因剔除小鼠也死于胚胎10.5天，原位检测到卵黄囊的血管分支减少，循环中的红细胞减少导致外观贫血。但进一步的体外实验分析其造血潜能是正常的(卵黄囊造血前体细胞的集落形成能力正常：CFU-GM和CFU-Mix集落数量正常，红系造血集落的数量还显著增高)。而卵黄囊的血管发育缺陷是胚胎期死亡的主要原因(基因剔除的原代内皮细胞纤连蛋白产生减少、迁移功能异常，增殖失去对TGF-β抑制效应的反应，导致了血管形成障碍)。上述表型提示TGF-β信号缺失造成的卵黄囊贫血并非造血前体的内在缺陷，而是卵黄囊异常的微环境使造血前体无法正常分化成熟。除了采用基因剔除的动物模型，胚胎干细胞的体外造血分化体系也为全面认识TGF-β信号对胚胎早期造血发育的作用提供了重要线索。通过考察胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)体外造血分化过程中各种发育与造血相关基因(编码细胞因子、转录因子、细胞表面抗原)的表达，目前认为：体外模型和体内的发育事件是大致平行的，拟胚体造血可以在一定程度上模拟卵黄囊的原始造血[10]。尽管缺乏对TGF-β及其受体基因剔除的ES细胞体外造血分化的研究，但应用此体系针对胞内信号分子的研究发现，Smad5基因剔除的ES细胞，其原始红系增殖缺陷，而定向造血是显著增强的。这种效应是通过介导TGF-β的信号而实现，并且具有基因剂量效应[11]。我们对Smad3基因剔除的ES细胞体外造血的初步研究也获得了相似的结果(未发表)。这提示阻断TGF-β信号(或至少部分阻断)，确有可能一定程度影响卵黄囊的原始造血。TGF-β信号分子对胎肝造血发育的作用，主要来源于对TGF-β2剔除鼠胎肝造血的研究。TGF-β2基因剔除小鼠由于多种发育缺陷导致新生期死亡[12]。纯合子和野生型在胎肝造血干细胞的数量、体外增殖能力以及第一代受体鼠的造血重建功能上没有区别。然而，杂合子和纯合子的第二代造血重建能力显著下降，提示TGF-β2对胎肝造血干细胞维持多次重建的能力是必要的[13]。同卵黄囊造血一样，胎肝造血也可能受到继发因素的影响。对Smad2和Smad3双杂合小鼠的表型分析显示：80%双杂合小鼠出现的严重胎肝发育障碍[14]，可能是间接影响胎肝造血的重要因素。我们发现Smad3基因剔除小鼠的胎肝具有正常的组织结构和造血功能(未发表)，但Smad2蛋白表达升高[14]，TGF-β作用后Smad2磷酸化水平增强，均提示在胎肝发育中有信号分子功能的代偿(未发表)。

　　TGF-β信号对成体造血功能的影响

　　1992年Shull等[15]及Kulkarni等[16]两个研究小组几乎同时报道了应用基因打靶技术建立的TGF-β基因剔除小鼠中造血和免疫系统的异常。他们分别应用了针对TGF-β不同外显子的打靶载体。虽然基因剔除小鼠在出生2-3周内无明显异常表型，但随后很快出现消耗、衰竭症状，3-4周龄死亡。组织学分析提示涉及心脏、胃、肝、肺、胰腺、唾液腺等多系统的不同程度的混合炎性细胞浸润和组织坏死，而皮肤、胸腺、骨髓没有明显的炎症累及。血液系统检测骨髓容积和细胞比例正常[16]，而外周血白细胞总数升高，尤其是不成熟中性粒细胞和单核细胞的绝对值显著增高[15]。上述改变强烈提示： ①基因剔除小鼠的免疫和炎症系统功能异常; ②血液系统的改变或者是原发性的造血前体细胞失去对TGF-β反应的直接结果，或者为继发于炎性因子刺激的血象反映。由于信号分子的完全剔除，表型的多样性给功能分析带来一定困扰：一种可能是继发因素的影响，正如上述报道中血象可能受到炎症影响一样;一种是胚胎发育早期缺陷的累积效应，使得靶分子在成体中的功能很难评价。在目前的研究中，有两种策略可以分别在基因剔除的空间和时间上部分解决上述问题：一是采用无免疫细胞的造血干细胞移植模型，使得受体鼠只有造血系统来源于基因缺陷的细胞;一是成体水平的显性负效转基因或诱导性剔除，使正常发育的小鼠在成体水平再出现信号的阻断，进一步结合移植实验则可更精确地评价信号通路对成体造血功能的影响。上述策略尤其被用于由于基因剔除可导致胚胎期死亡的TβRI和TβRII。Shah等[17]应用携带可表达显性负效TβRII的逆转录病毒载体，体外感染小鼠的骨髓细胞后重建致死剂量照射小鼠的造血和免疫系统。在确认受者鼠中来源于造血前体的所有细胞中TGF-β信号被阻断后，发现受者鼠除了出现炎症表型(以肺部和支气管的炎性细胞浸润为特征)外，还表现为脾脏中髓系的显著扩增，继而受者鼠在移植后3-4月内出现明显的恶液质和高死亡率。尽管显性负效TβRII载体感染的骨髓造血前体细胞可有效重建受者鼠的造血，但第一代受者鼠的造血干/祖细胞不能再重建致死剂量照射的第二代受者鼠，提示体内阻断TGF-β信号通路的HSC的造血重建功能可能受到影响[17]。另一研究小组应用Cre/loxP系统，在成体小鼠水平进行TβRII的诱导性剔除，通过鉴定骨髓来源单个造血集落的基因型和检测诱导后的骨髓集落形成细胞失去对TGF-β抑制效应的反应，验证了诱导性剔除导致信号通路阻断的有效性。尽管诱导剔除的小鼠出现了多器官的多发炎症(病变主要累及胃、胰腺和肺)和早期死亡，但小鼠的造血平衡未破坏：骨髓容积正常;外周血细胞白细胞、红细胞计数正常;反映祖细胞水平的BFU-E、CFU-Meg、CFU-GM在集落形态和数量上均正常[18]。但该作者着重于免疫功能的观察，并没有对造血干细胞的重建功能进行深入的研究。为更加有针对性地研究TGF-β信号通路对成体小鼠造血稳态的影响，Larsson等[19]应用Cre/loxP系统在成体小鼠水平进行TβRI的诱导性剔除。除了发现剔除小鼠的造血稳态可维持(不同阶段的造血祖细胞和成熟血细胞的数量功能正常)，还为了避免免疫活性细胞对造血系统的继发影响，采用竞争重建实验将去除T细胞的骨髓细胞移植给免疫缺陷的受者鼠，并在此基础上再进行二次移植。结果表明， TGF-β信号阻断后小鼠的造血干细胞尽管体外的增殖能力增强，但在体内环境中具有正常的造血重建功能。进一步，该小组应用同样的条件剔除小鼠，考察造血干细胞在清髓处理和系列移植的强烈应激条件下的增殖和稳态维持情况，结果提示内源性的TGF-β对于成体小鼠的造血干细胞功能和造血稳态的维持不是必需的[20]。TGF-β2与TGF-β1具有高度同源性，并且通过同一受体复合物传递信号，但与TGF-β1显著不同的是，其杂合子就有很突出的异常造血表型：除了骨髓容积和造血干细胞数量的减少，其造血重建功能也有显著的减低，并且随着重建代数的增多更突出。这提示TGF-β2是造血干细胞的重要正向调节因子。TGF-β2在造血干细胞重建造血过程中，可能是作为细胞周期的进入信号发挥作用[13]。胞内信号分子中与造血关系最为密切的是Smad3。同样作为传递TGF-β信号的R-Smads，Smad2基因剔除小鼠死于胚胎7.5-8.5天的中胚层发育缺陷，而Smad3基因剔除小鼠胚胎发育正常，出生后才逐渐出现表型[21]。1999年，Yang等[22]及Datto等[23]两个研究小组同时报道了应用基因打靶技术建立的Smad3基因剔除小鼠，纯合子小鼠出生3周后出现衰弱、消耗，1-8月龄死亡。同TGF-β相似的是，基因剔除纯合子小鼠表现为免疫功能异常导致的粘膜多发慢性炎症[22]。血液学改变主要为：外周血象的白细胞升高，各类白细胞绝对值均增高，尤以中性粒和单核细胞比例增高明显[22，24];血小板数量增高[24-27];而红细胞计数是正常[22，24-27]。对Smad3基因剔除小鼠造血祖细胞的进一步分析显示：Smad3基因剔除小鼠CFU-GM增多，CFU-GEMM和CFU-S减少[24]。部分纯合子小鼠还伴有肝脾的髓外造血[22]。上述结果提示Smad3基因剔除小鼠的成体造血稳态受到影响。由于抑制型Smads的过表达亦可达到阻断TGF-β信号通路的效应，Blank等[28]应用过表达Smad7的骨髓移植实验考察造血干细胞的重建功能，发现TGF-β信号的胞内阻断，使造血干细胞的体内重建能力增强，但是体外的结果却恰恰相反：在无基质细胞层的液体培养体系中，过表达Smad7的造血干细胞的增殖能力是下降的。由于Smad7的过表达阻断了全部的胞内Smads信号，包括通过Smads传递的BMP等信号，上述结果一定程度上反映了TGF-β和BMP等信号对造血干细胞的综合效应。

　　结语

　　基因剔除技术为研究靶分子在体内环境下对个体发育的作用提供了非常好的工具。与体外实验不同，基因剔除的模式生物表型更多的是反映在生理状况的微环境中，分子网络相互调节和细胞之间相互作用的综合结果：一个无差异的表型可能是信号分子功能冗余或相互代偿的结果，而一个有差异的表型也可能是微环境中继发因素的影响[9]。因此，我们在进行基因剔除动物模型的表型分析时，结合体外功能实验的精巧的实验设计，是得到靶基因真实功能的结论所必需。造血系统和免疫系统从发育学角度密不可分，它们来源于共同的造血干细胞。对于TGF-β信号来讲，由于它对免疫系统的重要调控作用，使造血表型的分析不免受到干扰。因此我们在实验设计和分析研究结论时，应更加慎重考虑其可靠性。研究表明，TGF-β信号对胚胎造血发育的影响，更倾向于是继发缺陷。卵黄囊造血主要继发于卵黄囊的血管生成障碍[9]，而胎肝造血则继发于肝脏的发育异常[14]。对于成体造血，在认为白细胞增高[15]和髓系扩增的表型[17]都可能继发于免疫炎症反应后，TGF-β信号缺失对造血稳态的维持是没有影响的[18，19]。这与大量丰富的体外实验所证实的TGF-β是造血干细胞重要负调控因子的结论形成鲜明对比。有趣的是，许多其它的细胞类型，如上皮细胞和免疫系统，TGF-β基因剔除模型和体外实验结果是非常一致的[9，18]。由于体内微环境和体外实验的条件不同，这种体内体外实验结果的巨大差异表明TGF-β对造血系统的作用显著依赖于微环境的具体情况[28，29]。在个体水平，TGF-β信号对造血发育并不必需，一种可能是在造血发育过程中，TGF-β信号确实不重要;而更可能的情况是，由于功能的重要性，TGF-β信号存在体内的功能冗余或代偿，在TGF-β2和Smad3基因剔除小鼠中出现更为突出的造血表型[13，22，24]，这恰恰表明TGF-β信号通路中的某一类分子/信号在造血发育中确有重要作用，而完全阻断信号通路(受体水平的剔除)，则可能因信号的代偿和平衡使表型得到纠正。而在造血发育中，TGF-β信号通路同其它的信号通路之间，以及TGF-β下游的不同胞内信号分子之间，是如何相互作用和调节，又通过怎样的机制，都将有待进一步探索和明确。

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