生理剂量雄激素在雄性大鼠实验性血栓形成中的调节作用△

　　作者：李世军,李小鹰*,李燕,李健　　作者单位：中国人民解放军总医院心血管一科，北京 100853

　　【摘要】目的研究生理剂量雄激素在实验性血栓形成中的作用，并进一步探讨雄激素对凝血与纤溶系统的调节。方法 成年雄性Wistar大鼠去势模型与实验性血栓模型制备;血浆睾酮(testosterone, T)应用ADVIA Centaur Immunoassay System测定;而二氢睾酮(dihydrotestosterone, DHT)应用酶联免疫吸附测定(ELISA);凝血与纤溶参数采用STAR 血凝分析仪检测;血浆黏度应用SA6000自动血液流变学检测仪测定。结果 雄性大鼠去势后血浆睾酮与二氢睾酮明显降低(7.94±3.07 nmol/L vs 0.96±0.09 nmol/L;1.76±0.77 nmol/L vs 0.1±0.02 nmol/L，P均<0.05)。在40%三氯化铁(40%FeCl3)刺激下，去势大鼠腹主动脉血栓形成的面积与重量明显增加(1157.38±68.74 μm2 vs 969.43±22.66 μm2;7.17±1.72 mg vs 5.17±1.17 mg，P均<0.05)。去势大鼠血浆凝血酶原活动度(PA%)显著升高(68.00±4.74 vs 53.00±1.81，P<0.05)，而凝血酶原时间(PT)、活化的部分凝血酶时间(aPTT)、国际标准化比值(INR)显著降低(P均<0.05)。去势大鼠血浆纤维蛋白原(Fbg)、纤溶酶原活性(PLG:A)、D二聚体(Ddimer)、血浆黏度与假手术大鼠间无差别(P均>0.05)。结论 生理浓度的雄激素介导对雄性大鼠凝血过程的调节，抑制实验性血栓的形成。

　　【关键词】 血栓; 雄激素; 大鼠

　　Effect of Physiological Concentration of Androgen on Experimental Thrombosis in Male Rats LI Shijun, LI Xiaoying, LI Yan, LI Jian. ( Division of Geriatric Cardiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing,100853 China)

　　Abstract： Objectives The aim of our study is to if experimental thrombosis is regulated by physiological doses of androgen via modulating coagulation and fibrinolytic processes. Methods Castrated models and experimental thrombosis models of male rats were prepared. Total plasma testosterone was measured using ADVIA Centaur Immunoassay System. Whereas the dihydrotestosterone (DHT) levels were measured using a DHT ELISA kit. s of blood coagulation and fibrinolytic system were assayed using STAR Coagulation analyzers, and plasma viscosity was tested using SA6000 automated hemorrheology tester. Results Total plasma testosterone and DHT were significantly lower in castrated rats than in normal rats (7.94±3.07 nmol/L vs 0.96±0.09 nmol/L; 1.76±0.77 nmol/L vs 0.1±0.02 nmol/L, (all P<0.05). Castration caused significant increase in the thrombus area and weight in castrated rats as compared with control group (1157.38±68.74 μm2 vs 969.43±22.66 μm2;7.17±1.72 mg vs 5.17±1.17 mg, all P<0.05). Prothrombin activity (PA%) was higher, and PT , aPTT and INR were lower in castrated rats than in normal rats (all P<0.05). There weren’t significant difference in FIB, Ddimer and plasma between in castrated rats and in normal rats (all P>0.05). Conclusion Inhibition of experimental thrombosis by physiological doses of androgen is mediated via modulating coagulation processes in male rats.

　　Key words: Thrombosis; Androgen; Rats

　　动脉粥样硬化血栓形成以动脉粥样硬化斑块突然破裂和血栓形成为特征，是急性冠脉综合征(ACS)和心血管病者死亡的主要原因。抗凝是防治ACS的重要策略。传统观点认为高水平雄激素与冠心病危险性增加有关。滥用雄激素的运动员血栓形成与雄激素诱发凝血异常有关[1]。近来，低雄激素水平在男性ACS中的作用受到越来越多的关注[2]。男性随着年龄增加，睾酮水平下降，而心血管疾病的发病率却增加。雄激素降低与脂代谢紊乱、肥胖、胰岛素抵抗、纤维蛋白原增加密切相关。然而，生理水平雄激素在动脉血栓形成中的作用尚不完全清楚。本文的研究目的是阐释生理剂量雄激素在实验性血栓形成中的作用，并进一步探讨生理剂量雄激素对凝血与纤溶系统的调节。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂 二氢睾酮(Dihydrotestosterone, DHT) ELISA试剂盒购自RapidBio 公司(California, USA)。凝血与纤溶参数测定采用法国STAGO公司检测试剂盒。

　　1.2 动物 成熟雄性Wistar大鼠(200±40 g)(购自中国人民解放军总医院医学动物实验中心)16只，饲养条件为光照时间12 h/d，相对湿度55%±5%,室温20±2℃。

　　1.3 动物模型制备

　　1.3.1 去势模型 16只成熟雄性Wistar大鼠以标准鼠饲料喂养、自由饮水1周。随机分为2组(对照组10只，去势组6只)，并随机进行假手术(切开阴囊皮肤后缝合)或戊巴比妥钠(50 mg/kg体重)腹腔麻醉下切除双侧睾丸，行去势手术。手术2周后制备腹主动脉血栓模型。

　　1.3.2 动脉血栓模型 参照Kurtz与Saldeen的方法制备动脉血栓模型[3,4]。大鼠用戊巴比妥钠(50 mg/kg体重)腹腔麻醉，打开腹腔，分离腹主动脉段，长度≥1.0 cm。放入0.6 cm宽的封口胶条(American National Can产品)备用。将Whatman滤纸修剪为长×宽：1.0 cm×0.5 cm的滤纸条，浸透PBS溶液的滤纸条环抱贴于假手术大鼠(4只)已分离备用的腹主动脉段;浸透40%三氯化铁(FeCl3)溶液的滤纸条分别环抱贴于假手术大鼠(6只)和去势大鼠(6只)已分离备用的腹主动脉段，均用预置的封口胶条封住。从腹主动脉环抱上滤纸条起计时，连续观察60 min后取下滤纸条。用游标卡尺在滤纸环抱处精确截取0.5 cm 长血管段,称重,取出血栓后的血管再称重,前后两者相减即为该0.5 cm 长血管段内血栓的重量。[5] 截剩的该部位腹主动脉段用PBS冲洗,放入10%甲醛固定，按常规石蜡包埋，横切片，HE染色。计算机图像分析系统(ImagePro Plus Version 5.0.1)进行图像分析，测量血管横切面上血栓面积。

　　1.4 血浆睾酮与二氢睾酮浓度测定 血浆睾酮采用Advia Centaur免疫检测系统 (Bayer, Germany) 自动检测。血浆二氢睾酮采用二氢睾酮ELISA试剂盒(RapidBio Lab, Calabasas, California, USA)，按试剂盒推荐步骤检测。

　　1.5 凝血与纤溶等指标检测 凝血酶原时间(PT)、活化的部分凝血酶时间(aPTT)、国际标准化比值(INR)、血浆纤维蛋白原(Fbg)、纤溶酶原活性(PLG:A)、D二聚体(Ddimer) 用STAR血凝分析仪(法国STAGO公司)检测;血浆黏度应用SA6000自动血液流变学检测仪(北京赛科希德公司)测定。

　　1.6 统计学分析 所有数据均以均数±标准差(x± s)表示，两组间均数比较采用t检验，应用SPSS统计软件进行统计分析。P<0.05被认为具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 去势对大鼠血浆雄激素水平的影响 雄性大鼠去势后血浆睾酮与二氢睾酮明显降低。见表1表1 去势对大鼠血浆雄激素水平的影响

　　2.2 去势对大鼠腹主动脉血栓面积重量与形态的影响 在40%FeCl3刺激下,去势大鼠腹主动脉血栓形成的面积与重量明显增加。光镜下见浸润PBS溶液的假手术大鼠腹主动脉无血栓形成;浸润 40% FeCl3的去势大鼠腹主动脉管腔被血栓充塞仅剩一条窄缝，血栓块致密;浸润 40% FeCl3的 假手术大鼠腹主动脉管腔空隙增大，血栓块较松散。见表2、图1。表2 去势对大鼠腹主动脉血栓面积重量的影响

　　2.3 去势对大鼠凝血、纤溶与血浆黏度的影响 以往的研究显示去势造成雄兔PT和aPTT缩短，而Fbg和D二聚体明显升高[6]。目前的研究进一步证明去势大鼠血浆凝血酶原活动度(PA%)显著升高，PT、aPTT、INR显著降低(P均<0.05)。然而，去势大鼠血浆Fbg、PLG:A、Ddimer、血浆黏度与对照大鼠差异无显著性(P均>0.05)。见表3。 表3 去势对大鼠凝血、纤溶与血浆黏度的影响

　　3 讨 论

　　以往的研究显示，血睾酮水平高于或低于正常范围均增加冠心病的危险[7]，急性血栓形成与雄激素滥用有关 [2]。高剂量雄激素降低环氧化酶活性，使血小板激活，促进血栓形成 [8] 。 近来，低雄激素水平在男性ACS中的作用受到越来越多的关注。男性随着年龄增加，睾酮水平下降[9,10] 。而冠心病的发病率却增加[11] 。 睾酮浓度较低的患者易于并发血栓，造成心肌梗死[12] 。 雄激素降低与脂代谢紊乱、肥胖、胰岛素抵抗、纤维蛋白原增加密切相关。然而，生理水平雄激素在动脉血栓形成中的作用尚不完全清楚。

　　目前的研究建立了雄性大鼠去势模型，以造成大鼠低雄激素状态，结果发现大鼠去势2周后血浆睾酮与二氢睾酮浓度显著降低，提示大鼠去势成功。本研究中采用化学损伤法制备血栓模型，血管内膜被化学物质损伤后，暴露内皮下胶原纤维，诱发血小板黏附、聚集,形成血栓，是当前较常用的血栓模型制备方法。Bucha等[13] 应用5%硝酸银溶液制备冠状动脉血栓形成模型;刘小光等[14] 应用50%FeCl3溶液制备脑血栓形成。研究表明FeCl3诱导的动脉血栓属于内膜损伤引起血小板黏附、聚集、释放，致内源性凝血系统激活而形成的复合性血栓，且仅在动脉损伤的区域形成血栓[15] 。 由于FeCl3不仅价廉易得,且对血管的损伤作用可靠,已为不少学者采用[3,4,16] 。本研究中参照Kurtz与Saldeen的方法，采用FeCl3作为化学因子，成功地制备了腹主动脉血栓模型。结果显示在40% FeCl3刺激下，去势大鼠腹主动脉血栓形成的面积与重量明显增加。去势大鼠腹主动脉管腔被血栓充塞仅剩一条窄缝，血栓块致密;而假手术大鼠腹主动脉管腔空隙增大，血栓块较松散。提示生理水平的雄激素对动脉血栓形成具有抑制作用。

　　一些研究显示血浆睾酮水平与VIIc负相关[17,18] 。 Kohli等[19]证明在晚期前列腺癌(雄激素去势)患者凝血酶原片段1+2(F1+2)与凝血酶抗凝血酶复合物(TAT)显著升高。以往的研究显示雄兔去势可以造成PT和aPTT缩短、纤维蛋白原与Ddimers升高 [6]。目前的研究进一步证明雄性大鼠去势可以造成PT和aPTT缩短。这一资料提示生理剂量雄激素通过阻碍凝血激活，进而抑制动脉血栓的形成。去势引发PT和aPTT缩短是否与F1+2、TAT、VIIc升高有关，需要进一步证明。

　　以往的研究显示，血浆睾酮水平与组织型纤溶酶原激活物(tPA)呈正相关，与纤溶酶原激活物抑制物1(PAI1)和纤维蛋白原呈负相关[17,18]。男性心肌梗死患者总睾酮和生物有效性睾酮下降，然而PAII却显著升高，tPA活性显著减低[12]。给予性功能减低的男性补充生理剂量睾酮能够降低血清PAI1水平[20] 。 晚期前列腺癌(雄激素去势)患者Ddimers显著升高[21] 。然而，目前的研究Fbg、PLG:A、Ddimer在去势老鼠和正常老鼠间无显著差异。这结果与以往研究不同[6]。可能与动物种属有关，去势雄性老鼠凝血激活有足够的代偿，避免了继发性的纤维蛋白溶解。

　　综上所述，本研究认为生理浓度的雄激素介导对雄性大鼠凝血过程的调节，抑制实验性血栓的形成。

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