特发性血小板减少性紫癜患者外周血淋巴细胞共刺激分子的表达

　　作者：潘建玲,关秀茹,马学华,何昕　　作者单位：哈尔滨医科大学第五临床医学院 检验科, 大庆 163316; 　1哈尔滨医科大学第一临床医学院 实验诊断教研室, 哈尔滨 150001

　　【摘要】本研究探讨特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者外周血淋巴细胞共刺激分子CD80、CD86及其配体CD28的表达水平及白介素18的作用。应用免疫荧光标记和流式细胞技术检测34例ITP患者和34名正常人外周血淋巴细胞共刺激分子CD80、CD86及其配体CD28的表达，酶联免疫(ELISA)法测定血浆IL18。结果表明：ITP患者外周血淋巴细胞CD80、CD86表达率(4.21±2.27%, 7.19±5.16%)均明显高于正常对照组(2.34±0.87%，4.08±1.96%，P<0.01)。ITP组血浆IL18含量为(538.31±111.33)pg/ml，正常对照组血浆IL18含量为(489.44±49.07)pg/ml。IL18含量与血小板数量呈显著性负相关(r=-0.395， P<0.05)。结论： ITP患者CD80和CD86共刺激分子过度表达，患者血浆中IL18水平比正常对照组明显升高(P<0.05)，共刺激分子CD80、CD86与ITP发病密切相关，IL18在ITP发病机理中起重要作用。

　　【关键词】 特发性血小板减少性紫癜　共刺激分子　淋巴细胞　CD80　 CD86　 CD28　白介素18

　　Expression of Costimulatory Molecules and Role of Interleukin 18 in Peripheral Lymphocytes of Patients with Idiopathic Thrombocytopenic Purpura

　　PAN JianLing, GUAN XiuRu1, MA XueHua1, HE Xin

　　Department of Laboratory Examination, The Fifth Clinical Medical College, Harbin Medical University, Daqing 163316,China; 1Department of Laboratory Diagnosis, The First Clinical Medical College, Harbin Medical University, Harbin 150001,China

　　Abstract The objective of study was to investigate the expressions of CD80, CD86 and its ligand CD28 on peripheral lymphocytes in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), to explore the effect of interleukin 18 (IL18) and its clinical significance in ITP. The expressions of costimulatory molecules (CD80,CD86 and its ligand CD28)on peripheral lymphocytes from 34 ITP patients and 34 normal humans were detected by immunofluorescence and flow cytometry. The IL18 in the plasma was detected by using enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). The results showed that the expressions of CD80 and CD86 on peripheral lymphocytes from ITP patients were higher than that of the normal control (4.21±2.27%, 7.19±5.16% vs 2.34±0.87%，4.08±1.96%) (P<0.01); the concentration of IL18 in plasma of ITP patients was (538.31±111.33)pg/ml, but the concentration of IL18 in plasma of controls was (489.44±49.07)pg/ml. The level of IL18 negatively correlated with the platelet counts in peripheral blood (r=-0.395, P<0.05). It is concluded that the CD28/ CD80 and CD28/CD86 costimulatory molecules are overexpressed, when the IL18 level in ITP patients is obviously higher than that in normal controls. When ITP occurred, and the costimulatory molecules CD80 and CD86 are closely associated with ITP, it seems that IL18 may play an important role in ITP pathogenesis.

　　Key words idiopathic thrombocytopenic purpura; costimulatory molecule; lymphocyte; CD80; CD86; CD28; interleukin 18

　　J Exp Hematol 2007; 15(3):578-58

　　特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura , ITP)是一种出血性自身免疫性疾病，该病的特点是患者体内抗血小板抗体增多，血小板破坏过多而出血。其发病机制目前尚未完全明了，但确认与免疫应答异常有关。最近研究显示，ITP时存在着T、B淋巴细胞功能紊乱及其细胞因子异常[1]。在T、B淋巴细胞的相互作用过程中，共刺激分子(CD80、CD86、CD28)的作用是必需的。为探讨ITP的发病机制，我们应用免疫荧光标记和流式细胞技术检测了ITP患者外周血淋巴细胞CD80、CD86及其配体CD28的表达，并使用ELISA法检测了ITP患者血浆中白介素18(interleukin 18, IL18)的含量，研究共刺激分子的表达及IL18在ITP发病中的作用。

　　研究对象

　　34例ITP病人为2005年12月至2006年4月在哈尔滨医科大学第一临床医学院、黑龙江省血液病研究所及黑龙江省医院住院确诊为ITP的患者，年龄1-53岁，男15例、女19例，诊断符合张之南《血液病诊断及疗效标准》[2]。急性型27例，慢性型7例，其中儿童9例，成人25例。正常对照组34名，成人正常对照者为哈尔滨医科大学第一临床医学院体检中心选取体检结论正常的健康人。

　　材料

　　试剂采用藻红蛋白(PE)标记CD28、CD80、CD86鼠抗人单克隆抗体(CD28PE、CD80PE、CD86PE)以及相应同型对照抗体IgG1PE均为Becton Dickinson公司产品。IL18酶联免疫(ELISA)检测试剂盒为美国BPB公司产品，由大连泛邦公司提供。使用Becton Dickinson公司的流式细胞仪检测CD28、CD80、CD86阳性表达率，使用西班牙斑珀斯公司生产的BIOCELL 2010酶标仪检测IL18。

　　方法

　　采样 空腹采集静脉血2 ml， 用EDTAK2抗凝，待CD28、CD80、CD86测试完毕，分离血浆标本0.5 ml置于-20℃保存。

　　共刺激分子的检测 单克隆抗体标记后，分别取100 μl抗凝血放入4支实验管和1支对照管中，实验管分别加20 μl CD28PE、CD80PE、CD86PE，对照管加20 μl鼠抗人IgG1PE，室温避光孵育30分钟，然后加入细胞裂解液2 ml混匀，静置8分钟，300× g离心5分钟。弃上清，加入PBS缓冲液，混匀200×g离心5分钟。再弃上清，每管加入250 μl鞘液，重悬细胞，上流式细胞仪检测。用前向角散射和侧向角散射散点图区分细胞群体，门技术圈出分析的淋巴细胞群体。每份标本检测20 000个细胞。计算CD28、CD80及CD86阳性细胞比例。结果采用Macos 9.2型计算机及Cell Quest Plot软件进行资料采集和数据分析。

　　IL18的检测 使用ELISA法检测血浆IL18浓度，严格按照试剂盒说明书要求操作。

　　统计学处理

　　实验数据用 ±SD表示，利用 Microsoft Excel 数据分析系统统计实验数据，组间比较用t检验。IL18含量与血小板数量之间及CD80、CD86与血小板数之间进行相关性分析。

　　结 果

　　ITP患者与正常对照者外周血淋巴细胞共刺激分子表达率及血浆IL18含量见附表。由附表数据可见，ITP患者外周血淋巴细胞CD28表达率略高于正常对照组， 但无统计学意义; CD80、CD86表达率均明显高于正常对照组，提示CD28∶CD80和CD28∶CD86共刺激通路可能参与ITP的发病。进一步对急性、慢性ITP患者共刺激分子的表达率进行比较，急性型CD28、CD80和CD86的表达率均高于慢性组，但无统计学意义，这可能与收集的病例少有关;ITP儿童组与成人组 CD28、CD80和CD86的表达率也无统计学意义，可能与儿童组的病例少有关。ITP组比对照组血浆IL18水平明显增高，差别具有统计学意义。ITP急性组判别与慢性组相比及儿童组与成人组相比，血浆IL18含量增高，但无统计学意义。

　　对CD80、CD86与血小板水平之间的相关性分析表明：CD80与血小板数之间相关系数为 -0.19，两者之间无明显相关性(P>0.05)。CD86与血小板数之间相关系数为 -0.08，两者之间无明显相关性(P>0.05)。进一步分析ITP患者血浆IL18含量与血小板计数的相关性表明，r=-0.395，P=0.02，可见IL18含量与血小板数量呈显著性负相关(P<0.05) 。

　　讨 论

　　CD28、CD80和CD86都属于免疫球蛋白超家族成员，它们的基因高度同源， CD80和CD86与 CD28互为受/配体，T细胞表面的CD28分子与APC表面的相应配体CD80和CD86的结合可有效提供共刺激信号(第二激活信号)，在T细胞的激活过程中起重要作用。白介素18(interleukin 18, IL18)是近几年来发现的一种新的细胞因子，最初认为IL18是γ干扰素(interferonγ, IFNγ)的诱导因子(interferon gamma inducing factor, IGIF)，进一步的研究发现，IL18主要由单核巨噬系统产生,不仅能诱导IFNγ的生成，还与自身免疫性疾病的发生有着密切关系[3,4],因此我们同时也对IL18在特发性血小板减少性紫癜发病中的作用进行了研究。

　　我们研究发现，ITP患者的CD80、CD86表达率均明显高于正常对照组，CD28分子与CD80和CD86的结合增强，提高了细胞因子的基因表达，促进了T细胞活化;而活化的T细胞分泌的各种细胞因子又进一步促进了T淋巴细胞的过度增殖和分化。我们同时检测到ITP患者血浆中的IL18水平比正常对照组明显升高，因此共刺激分子(CD80、CD86)的过度表达促进了T细胞的活化，而Th细胞激活导致Th1/Th2平衡失调，提高了Th1型反应优势[3]，这势必增强IFNγ的分泌能力，使IFNγ诱导因子IL18含量增加， ITP时也有其他细胞因子的异常分泌，由于抗血小板自身抗体的产生受Th细胞和他们产生的细胞因子所控制[5]，因此ITP时免疫紊乱及异常刺激诱导B淋巴细胞分化为浆细胞，产生自身抗体，抗血小板自身抗体产生使血小板遭到破坏。另一方面，ITP患者IL18能增强Th1细胞上调功能性FasL的表达[6,7]，选择性地增强FasL介导的Th1细胞的细胞毒作用，通过FasFasL介导的细胞凋亡作用发挥生物学效应。同时IL18还通过促进FasL的表达直接增强NK细胞的杀伤活性[8]，杀伤异常表达自身抗原的血小板，引起血小板减少，参与ITP的发病。

　　研究数据分析表明，ITP患者IL18含量与血小板数量之间呈明显负相关，IL18含量越高，血小板数量越少，推测IL18与ITP发病程度密切相关，进一步表明血浆IL18水平在ITP发病机制上起着重要的作用。由于ITP患者IL18水平的增高诱导的是以Th1型细胞免疫反应为主，目前有研究显示，稳定缓解期的患者是Th2优势[9]，因此逆转Th1/Th2类细胞极化模式是研究ITP治疗的一个新方向。

　　【参考文献】

　　1Beardsley D. Pathophysiology of immune thrombocytopenic purpura. Blood, 2002; 16:13-14

　　2张之南主编. 血液病诊断及疗效标准.第二版，北京：科学出版社，1998: 279-289

　　3Lewkowich IP, HayGlass KT. Endogenous IFNgamma and IL18 production directly Limit induction of type 2 immunity in vivo, Eur J Immunol, 2002; 32: 3536-3545

　　4张鲁勤，葛晋源，郭玉琳等. 特发性血小板减少性紫癜患者血浆白介素18及其有关因子. 中国实验血液学杂志，2003; 11: 662-664

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　　9Mouzaki A,Theodoropoulou M, Gianakopoulos I, et al. Expression patterns of Th1 and Th2 cytokine genes in childhood idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) at presentation and their modulation by intravenous immunoglobulin G(IVIg) treatment:their role in prognosis. Blood, 2002:100:1774-1779