mPEG修饰红细胞Rh抗原稳定性的研究

　　作者：邱艳,檀英霞,章扬培　　作者单位：北京红十字血液中心，北京 100088;1军事医学科学院野战输血研究所，北京

　　【摘要】本研究旨在探究mPEG修饰的红细胞Rh抗原的稳定性。利用红细胞膜蛋白SDS-PAGE电泳技术分析mPEG修饰后红细胞膜蛋白与mPEG结合情况，用红细胞血影凝集实验及4℃ CPD保养液保存的修饰红细胞与匹配血液体外混血实验，观察mPEG修饰后红细胞Rh抗原被遮蔽的稳定性。结果发现：不同保存时间的mPEG修饰的红细胞在模拟输血(即混血前后)的血型保持不变，同时mPEG修饰的红细胞在保存过程中游离血红蛋白水平正常，并且混血后经37℃孵育的mPEG修饰的红细胞游离血红蛋白水平低于不混合的修饰的红细胞。比较分析PEG特异的碘染和考马斯亮蓝染的显色图谱发现，特殊的碘染显示出mPEG与红细胞膜蛋白结合的条带，mPEG-SPA与红细胞膜蛋白结合后导致蛋白分子迁移速度发生改变。mPEG修饰的红细胞血影凝集实验证实，修饰红细胞在质膜裂损后 mPEG仍有效地遮蔽抗原。结论：mPEG-SPA不论在红细胞膜蛋白被单独提取后，还是膜破损后以及存活状态下，均能与红细胞膜蛋白稳固结合。

　　【关键词】 mPEG修饰红细胞;Rh抗原;红细胞

　　Rh Antigen Stability of mPEG Modified Red Blood Cells　QIU Yan, ZHA Yi, TAN Ying-Xia,ZHANG Yang-Pei　Beijing Red Cross Blood Center, Beijing 100088, China; 1Institute of Transfusion Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China

　　AbstractThe objective of study was to investigate the Rh antigen stability of mPEG-modified RBC. RBC membrane protein SDS-PAGE technology was used to analyze the combination of the mPEG modified RBC membrane protein with mPEG molecules; the RBC ghost coagulation test and 4℃ CPD-preserved modified RBC mixed with matched blood were used to observe the stability of RBC Rh antigen camouflaged by mPEG. The results showed that the blood groups of stored mPEG-modified RBC were kept consistency before or after simulating transfusion, i.e. mixture of modified RBC with matched bloods, while the plasma hemoglobin after simulating transfusion was not only within the normal range during the storage, but also less than that before simulating transfusion even after incubation at 37℃. The electrophoresis pattern stained with iodine and Coomassie blue displayed the bands of mPEG combined with RBC memberane protein and the slow mobility of membrane protein. The hemagglutination of PEGylation RBC ghosts did not take place and mPEG still covered the antigen. In conclusion, mPEG-SPA can bind the erythrocyte with its extracted membrane protein in both ghosts and living erythrocytes.

　　Key words mPEG modified red blood cell; Rh antigen; red blood cell

　　mPEG-SPA 可以与蛋白质和多肽中的赖氨酸(K)、精氨酸(R)的胺基、组氨酸(H) 的咪唑基以及酪氨酸(Y)的羟基发生化学反应，形成共价结合键，从而结合到蛋白质多肽上[1]，达到遮蔽抗原的作用。mPEG与红细胞膜Rh抗原结合后是否稳定，进入人体后是否会脱落，这些问题关系到修饰后红细胞进入人体后的安全性。为此，我们采用mPEG修饰的红细胞膜蛋白SDS-PAGE电泳、红细胞血影凝集实验以及用4℃ CPD保养液保存的修饰红细胞与匹配血液进行的体外混血实验，对mPEG修饰后红细胞Rh抗原被遮蔽的稳定性进行了初步的研究。

　　材料和方法

　　样品

　　20 mmol/L mPEG-SPA 修饰的AB、RhDEeCc红细胞，AB、RhD-全血，RhD+血液血浆。

　　试剂

　　CPD保养液、低渗磷酸缓冲液(20 mOSM，pH 7.4)、 10 mmol/L Tris-盐酸低渗缓冲液、等渗液、电泳缓冲液、30%聚丙烯酰胺凝胶溶液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%分离胶、10%基层胶、0.25%考马斯亮蓝R-250、脱色液、样品处理液、蛋白分子量标准物(marker)。

　　仪器

　　倒置显微镜、KUBOTA2100离心机(Japan)、EBA12R Zentrifugen低温高速离心机(Beckman公司产品，Germany)、XMTB数显调节仪水浴锅(浙江余姚工业仪表二厂产品)、Mini-Protean Ⅱ型电泳仪(Bio-Rad公司产品，USA)、TS-1型脱色摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司产品)。

　　mPEG修饰红细胞体外稳定性检测

　　将CPD保存的血比容为35%的20 mmol/L mPEG-SPA 修饰的ABRhDEeCc红细胞、ABRhD-全血、RhD+血浆分装，于2-6℃保存并在储存第1、7、14、21天时取CPD保存的修饰的ABRhDEeCc红细胞50 μl，用间接抗人球蛋白试验鉴定血型后，分别加入250 μl的ABRhD-全血和RhD+血浆，以CPD保存的血比容为35%的20 mmol/L mPEG-SPA 修饰的ABRhDEeCc红细胞RhD-全血和RhD+血浆作为对照，在37℃摇动孵育24小时后，再次检测血型和血浆游离血红蛋白。

　　mPEG修饰的红细胞血影凝集实验

　　取未修饰和修饰的红细胞各40 μl，加10倍体积的PBS(pH 7.4)，4℃放置30分钟， 3500×g/min离心10分钟，弃上清，加入600　μl的低渗磷酸缓冲液，4℃放置30分钟， 3500×g/min离心10分钟，弃上清，低渗磷酸缓冲液洗涤4次， 3500×g/min离心10分钟，沉淀即为血影细胞。在血影细胞加入Rh anti-D 多抗后，在倒置显微镜下观察结果。

　　mPEG修饰的红细胞膜蛋白的SDS-PAGE分析

　　红细胞膜蛋白的提取取CPD抗凝血100 μl，以2000×g/min 10℃离心5分钟，除去血浆和灰白色血细胞层;另取mPEG-SPA修饰红细胞约40 μl，加预冷的等渗液将沉淀RBC悬浮，以2000×g/min 10℃离心5分钟，除去上清液，如此重复洗涤3遍;按1∶10(v/v)向沉淀RBC中加入预冷的低渗液，混匀后4℃放置至红细胞完全溶血;以1000×g/min， 4℃离心10分钟，除去上清液，将沉淀在4℃用低渗液6000×g/min离心5分钟，洗涤3次，获得白色的RBC膜样品。

　　电泳分别配制10%分离胶和基层胶，灌分离胶，37℃放置40分钟，待胶凝固，灌基层胶，放梳子组装电泳装置;将蛋白marker及取得的RBC膜样品各10 μl与5×样品缓冲液在Eppendorf管中混合;95℃加热5分钟，将蛋白变性;用微量加样枪将样品加入样品孔底部;180 V恒压电泳至溴酚蓝指示剂移动至电泳胶外。

　　PEG碘染色[2]将电泳后的胶放入容器内，在摇床上缓慢振荡的过程中加入20 ml 0.1 mol/L的高氯酸，15分钟后依次加入5 ml 5%氯化钡，2 ml 0.1 mol/L碘溶液。5分钟后见到碘染的PEG条带逐渐出现，拍照、记录结果。

　　考马斯亮蓝染色将碘染的胶放在蒸馏水中漂洗约20分钟，碘染条带逐渐消失;将约20 ml考马斯亮蓝染液放入盛胶的容器里，摇床缓慢振荡约2小时，将染液弃去，再在水中漂洗数次，然后加入脱色液，脱色的条带清晰，背景变浅，其中更换脱色液数次，拍照、记录结果。

　　统计学处理

　　采用SPSS 10.0软件对检测结果进行Chi-square检验。

　　结果

　　mPEG修饰红细胞体外稳定性

　　修饰的ABRhDEeCc红细胞在储存过程中和模拟输血过程(即与全血和血浆混合后于37℃孵育24小时), Rh血型D、E、e、Ch和c抗原未发生变化，mPEG修饰红细胞在保存过程中血浆游离血红蛋白水平正常，修饰的ABRhDEeCc红细胞在模拟输血过程后，游离血红蛋白未见升高，反而降低，且1组和6组在统计学有显著差异，1组和7组在统计学同样有显著差异(附表)。Table. Plasma free hemoglobin change in the process of blood mixture(略)

　　mPEG修饰的红细胞血影凝集

　　mPEG-SPA修饰前后的红细胞处理得到的血影和IgGM RhD多克隆抗体，用直接凝集实验进行鉴定，结果表明mPEG修饰前的红细胞发生了凝集，而mPEG-SPA修饰后的红细胞未发生凝集(图1)。

　　mPEG修饰的红细胞膜蛋白的SDS-PAGE电泳分析

　　红细胞膜蛋白经SDS-PAGE碘和钡染色后， 未修饰红细胞膜蛋白和蛋白 marker 均未出现， 只有 2.0 mmol/L mPEG-SPA 修饰的红细胞膜蛋白出现条带，主要是血影蛋白、条带3，条带 4.1和4.2及血型糖蛋白(图2);红细胞膜蛋白经SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后，蛋白marker、2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰的、未修饰的红细胞膜蛋白均出现条带;未修饰的红细胞膜条带3、条带 4.1、条带4.2、肌动蛋白和血型糖蛋白条带的迁移速度均快于修饰的红细胞膜蛋白条带(图3)。

　　讨论

　　mPEG与红细胞膜只有稳定结合，才能保证其输入人体后不脱落，被修饰的抗原不会暴露，因而不会导致机体产生免疫应答反应。在对重组蛋白、酶、药物等的应用和研究基础上发现，PEG与蛋白分子共价结合后会进一步吸附水分子，使蛋白分子具有一个PEG 和水分子包裹亲水外壳，这个外壳能有效地遮蔽蛋白质表面的抗原[3]。已有研究结果显示， Rh血型抗原膜外的1、2、3、4、5环上均存在与mPEG-SPA发生反应的氨基酸K 、R 、H和Y，后者是mPEG共价结合蛋白质氨基酸物质基础。因此，从理论上讲结合应是稳定的。由于目前缺乏成熟的修饰红细胞动物评价模型[4]，因此我们设计了mPEG修饰红细胞体外稳定性实验，结果表明：不同保存时间的mPEG修饰的红细胞在模拟输血即混血前后的血型保持不变，这一结果不仅支持修饰的红细胞血型在体外不变，而且也提示其进入体内应是稳定的;同时mPEG修饰的红细胞在保存过程中游离血红蛋白水平正常，并且混血后经37℃孵育的mPEG修饰的红细胞游离血红蛋白水平低于不混合的修饰红细胞，这不仅说明mPEG与红细胞的结合是稳固的，同时表明全血和血浆与保存期间的mPEG修饰红细胞混合，不仅不会导致红细胞结构和功能损伤，而且有利于mPEG修饰红细胞功能维持和恢复， mPEG仍稳固与红细胞结合起着遮蔽抗原的作用。已知，SDS-PAGE电泳分析可以显示红细胞膜上分子量从15 000-250 000的15种主要蛋白，包括血影蛋白(spectrin，MW：240 000;220 000)、锚蛋白(ankyrin)、条带3 (MW：100 000)、条带4.1、条带4.2、肌动蛋白(actin)和血型糖蛋白(glycophorin，MW:30 000)[5]。

　　Scott等[6]研究结果表明，与mPEG结合的膜蛋白会由于分子量的改变使电泳的带型发生变化，并且表现出剂量依赖性;而且已有的结果也表明，mPEG可以与红细胞膜蛋白血影蛋白、条带3、条带4.1、条带4.2、肌动蛋白和血型糖蛋白结合[7]。本研究中对保存期21天mPEG-SPA修饰的红细胞膜蛋白经SDS-PAGE电泳后，先用碘染色，脱色后再用考马斯亮蓝染色，比较分析PEG特异的碘染和考马斯亮蓝染色显色图谱，发现特殊的碘染色可以显示出mPEG与红细胞膜蛋白结合的条带，mPEG-SPA与红细胞膜蛋白结合后导致蛋白分子迁移速度发生改变。这一结果证实了mPEG-SPA即使在红细胞膜蛋白被单独提取后仍与与红细胞膜蛋白稳固结合的。 依据血影仍保持有抗原性，且可与相应抗体结合产生凝集现象的原理，我们的mPEG修饰的红细胞血影凝集实验不仅证实了修饰红细胞在质膜裂损后血影抗原仍能与mPEG结合，而且mPEG仍可有效地遮蔽抗原，使抗原不与相应抗体结合而不发生凝集现象，这一结果进一步证实mPEG-SPA与红细胞膜稳固结合。

　　【参考文献】

　　1Nektar company. Polyethylene glycol and derivatives for advanced PEGylation. Mol Engin Catal, 2003:1-19

　　2 Kurfurst MM. Detection and molecular weight determination of polyethylene glycol-modified hirudin by staining after sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem, 1992; 200: 244-248

　　3 Abuchowski A, van-Es T, Palczuk NC, et al. Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol. J Biol Chem, 1977; 252: 3578-3581

　　4 邱艳，檀英霞，李立立等. PEG修饰红细胞的动物实验. 中国实验血液学杂志，2006; 14: 816-821

　　5 汪堃仁.细胞生物学. 北京：北京师范大学出版社. 1988：61-63

　　6 Scott MD, Murad KL, Koumpouras F, et al. Chemical camouflage of antigenic determinants: stealth erythrocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 1997; 94:7566-7571

　　7 Luanne LP. Genetic Control of Blood Formation. 4th International Workshop on Monoclonal Antibodiesagainst Human red Blood Cells and Related Antigens, Paris 2001：Section 1 B-Rh Flow Cytometry - Version 1.1.