多发性骨髓瘤患者外周血与骨髓中瘤细胞的检测及临床意义

　　作者：蒋元强,李建勇,吴雨洁,杨慧,沈云峰,陈　　作者单位：：南京医科大学第一附属医院血液科，南京 210029;1南京医科大学附属无锡第一医院血液科，无锡 210002;基金项目：本课题受江苏省“135工程”医学重点人才基金资助，编号 RC2002044

　　【摘要】本研究探讨多发性骨髓瘤(MM)患者的循环骨髓瘤细胞(circulating myeloma cells, CMC)和骨髓骨髓瘤细胞(marrow myeloma cells, MMC)的相关性及其临床意义。采用四色流式细胞术对55例MM患者同时检测CMC和MMC的百分率，并结合患者的β2微球蛋白(β2-MG)、血浆白蛋白(Alb)水平、染色体核型、肾功能等预后相关指标进行系统分析。将患者分成4组：A组为同时检测到CMC和MMC患者;B组为仅检测到MMC患者;C组为仅检测到CMC患者;D组为未检测到瘤细胞患者。结果发现：与其他各组相比，A组的β2-MG和肌酐浓度显著增高，白蛋白水平明显低下。就上述预后因素而言，在检测到与未检测到骨髓瘤细胞患者之间，差异有统计学意义。初发、复发/难治患者的CMC和MMC百分率明显高于部分缓解和完全缓解的患者。骨髓瘤患者CMC与MMC显著相关。结论：骨髓瘤患者CMC和MMC百分率不仅反映肿瘤负荷，而且预示病情进展，特别是同时检测到CMC和MMC的多发性骨髓瘤患者。

　　【关键词】 多发性骨髓瘤;骨髓瘤细胞;循环骨髓瘤细胞;骨髓骨髓瘤细胞

　　Detection of Circulating and Bone Marrow Myeloma Cells in Patients with Multiple Myeloma and Its Clinical Significance　JIANG Yuan-Qiang, LI Jian-Yong, WU Yu-Jie, YANG Hui, SHEN Yun-Feng, CHEN Li-Juan， XU Wei, QIAN Si-Xuan, WU Han-Xin, LU Hua, SHEN Rui-Lan　Department of Hematology, The First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China; 1Department of Hematology, The Wuxi First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Wuxi 214002, China

　　AbstractThis study was aimed to investigate the correlation between circulating myeloma cells (CMC) and bone marrow myeloma cells (MMC) in patients with multiple myeloma (MM)and its clinical significance. Four-color flow cytometry was used to detect the percentage of CMC and MMC in 55 patients with MM. Other prognosis-associated factors such as β2 microglobulin (β2-MG), serum albumin (Alb), chromosomal abnormalities and renal function were simultaneously analyzed. The patients were divided into four groups: group A, in which CMC and MMC were simultaneously detected; group B, in which only MMC were detected; group C, in which only CMC were detected; group D, in which no myeloma cells were detected in peripheral blood or bone marrow. The results showed that the concentrations of β2-MG and creatinine were significantly increased and Alb markedly decreased in group A as compared with other groups. Statistical differences existed in the above-mentioned factors between patients with myeloma cells detected and not detected. The percentages of CMC or MMC in newly diagnosed, refractory and relapsed patients were apparently higher than those in patients with partial and complete remission, respectively. CMC were strikingly correlated with MMC. It is concluded that the percentages of CMC and MMC not only imply tumor load in MM patients, but also predict the progression of MM, espectively for patients with MM, in those patients CMC and MMC were simultaneously detected.

　　Key wordsmultiple myeloma; myeloma cell; circulating myeloma cell; bone marrw myeloma cell

　　多发性骨髓瘤(MM) 是以浆细胞的异常增生为特征的恶性肿瘤性疾病，临床表现多样，预后相关因素多而复杂。对其预后相关因素作系统的分析可直接指导临床治疗方案的选择及疗效和预后的评估。 本研究根据骨髓瘤细胞(MC)的免疫表型特征， 采用四色流式细胞术同时检测MM患者外周血和

　　骨髓中MC的比例，探讨二者的相关性及其临床意义。

　　材料和方法

　　病例

　　2002年2月-2005年12月同时检测外周血循环骨髓瘤细胞(circulating myeloma cells, CMC)和骨髓骨髓瘤细胞(marrow myeloma cells, MMC)的MM患者55例，其中男34例，女21例，年龄44-81岁，中位年龄58.5岁。患者均以临床表现、骨髓检查、X 线摄片、生化和免疫学指标等确诊，诊断标准见文献[1]，其中IgG型31例、IgA型12例、轻链型10例、IgM型1例、不分泌型1例。按Durie-Salmon 分期法(D-S临床分期)[2]：Ⅰ期6例，占10.91%;Ⅱ期18例，占32.73%;Ⅲ期31例，占56.36%。按新的多发性骨髓瘤国际分期(ISS)[3]：Ⅰ期13例，占23.63%;Ⅱ期20例，占36.36%;Ⅲ期22例，占40%。有肾功能损害15例，肾功能正常40例。

　　实验试剂与仪器

　　单克隆抗体包括CD19-ECD、CD45-FITC、CD56-PE、CD138-PC5等及其相应的标记荧光素的同型对照、PE标记的同型对照均为美国Caltag公司产品(clone 1E7.2)，其余单克隆抗体均为法国Immunotech公司产品。Epics XL型流式细胞仪为Beckman-Coulter公司产品，分析采用Expo32-ADC分析软件。

　　流式细胞术检测

　　分别新鲜抽取同一例MM患者肝素抗凝的外周血(5 ml)和骨髓标本(3 ml)，在6小时内，用密度梯度离心法分别分离标本中单个核细胞。将单个核细胞数调整至1×106/ml，取100 μl加CD19-ECD、CD45-FITC、CD56-PE、CD138-PC5各20 μl，避光放置15分钟，加Fix &Perm 试剂盒A固定液100 μl，避光放置 15分钟，加PBS 2 ml， 400×g离心5分钟，弃上清，再加1.5 ml PBS重悬，然后上机检测，对外周血至少分析50 000个细胞，对骨髓标本分析30 000个细胞;同时设同型对照管。检测方法参见文献[4]。

　　定义及判断标准

　　分别检测出由单克隆抗体CD19-、CD45+、CD56+、CD138+标识的CMC及MMC百分数，按Rawstron等[5]检测MM微小残留病灶定义标准，把流式细胞术检测瘤细胞表达百分数的有效值定为>0.01%为阳性，<0.01%为阴性。患者分为4组。A组：同时检出CMC和MMC的患者;B组：只检出MMC的患者;C组：只检出CMC的患者;D组：都未检出MC的病例。按国内MM的诊断标准[1]，根据患者骨髓瘤细胞蛋白水平、骨髓中原浆细胞的比例、溶骨性病变的数目和大小等，分为初发及复发/难治组(包括初诊12 例;原发难治2例;缓解后病情又有进展5例)和缓解组(其中部分缓解28例，完全缓解8例)。结合临床上患者的β2微球蛋白(β2-MG)、血清白蛋白(Alb)水平、骨髓染色体核型异常、乳酸脱氢酶(LDH)水平、D-S临床分期、ISS分期、骨髓原浆细胞百分比、肾功能等预后相关指标进行系统性分析，研究相应的临床意义。

　　统计学分析

　　用确切概率法和卡方检验法分别检验各组别之间CMC和MMC与其他MM预后因素的统计学意义，用t检验检测初发、复发/难治及部分缓解患者之间瘤细胞表达的差异，用Pearson分布法检测CMC阳性与MMC阳性表达的相关性。

　　结果

　　A、B、C、D组病例的构成比及瘤细胞的百分比，CMC、MMC间的相关性

　　A组13例中，初发8例，难治1例，缓解后病情又有进展2例，部分缓解2例，无完全缓解患者。检出CMC、MMC的平均百分比分别是3.57%(0.37%-24.8%)、17.9%(1.41%-74.6%)，13例中初发及复发/难治患者占84.62%。B组13例患者中，初发3例，难治1例，部分缓解后病情又有进展2例，部分缓解7例。骨髓标本中MMC平均百分比为9.94%(3.22%-31.4%)，13例中初发及复发/难治患者占46.15%。C组4例中，初发1例，缓解后病情又有进展1例，部分缓解2例。CMC的平均百分比为0.95%(0.16%-1.4%)，4例中初发及复发患者占50%。D组25例患者中部分缓解 17例，完全缓解 8例均未检出CMC和MMC。检测CMC阳性与MMC阳性表达的Pearson点相关系数rn=0.3912(χ2=8.4156，P=0.004)，有明显的统计学意义。详细资料见表1。MM病人CMC和MMC的流式图见图1、图2。Table 1. Distribution of MM patients in each group and percentage of CMC and MMC(略)

　　A、B、C、D组和其他临床预后因素的关系

　　A、B、C、D 4组病例中D组β2-MG和Alb的中位值分别为2.36 g/L和28.61 g/L，较其他3组明显低;染色体异常核型病例数(包括数目异常和结构异常)各组间的所占的百分比分别为53.84%、23.07%、25%、20%，A组最高;LDH中位值在D组是163.42 U/L，在4组中最低;骨髓原浆细胞百分比在4组中有显著差异，A组最高为33.36%。详见表2。Table 2. Prognosis-associated factors in each group of MM patients(略)

　　初发及复发/难治和部分缓解患者的瘤细胞检测

　　检测结果列于表3。用t检验比较初发及复发/难治组与部分缓解组患者组中的CMC和MMC，均具有显著性统计学意义(P值都小于0.001)。Table 3. CMC and MMC in newly diagnosed, relapsed/refractory, PR and CR cases of MM(略)

　　检测到、未检测到瘤细胞组与其他预后因素的相关性

　　把检测到MC的A、B、C 3组共30例患者与D组无MC表达的25例患者进行了比较，除骨髓染色体异常的P值大于0.05而无统计学意义之外，其余检验值β2-MG >3.5 mg/L、Alb>35 g/L、有无肾功能损害等3个因数的P值分别小于0.05、0.05、0.01，二组之间均有明显的统计学意义(表4)。Table 4. Other prognosis-associated factors in MC positive and negative patients with MM(略)

　　A、B组与预后因素相关性

　　检测结果见表5。对比A、B 2组患者β2-MG水平(检验值3.5 mg/L)、Alb水平(检验值在35 g/L)、肾功能指标均显示其差异有明显统计学意义(P值分别为： 0.02、0.02、、0.02)。染色体异常在二组间无明显差异(P=0.09)。Table 5. Other prognostic factors in groups A and B of MM patients(略)

　　讨论

　　多发性骨髓瘤(MM)是克隆性的浆细胞恶性肿瘤，病因不明，好发于老年人，约占血液恶性肿瘤的10%。近年来虽然随着治疗方案的改进，对MM的疗效有了较大的提高，但MM仍然是一种不可治愈的疾病[6]，因此对MM预后因素检测并进行评估分析，对指导临床治疗尤为重要。与骨髓浆细胞标记指数一样，流式细胞术检测骨髓中MM同样是反映肿瘤细胞的负荷及增殖活性的预后因素[7]。Garcia-Sanz 等[8]用流式细胞术检测MMC在S期的比例，发现S期的比例和MM患者生存期密切相关，是对预后影响最大的因素之一。Witzig等[9]用流式细胞术检测MM患者的外周血中的CMC，并认为CMC也能独立反映了肿瘤细胞的负荷，还可能与肿瘤的迁移能力有关。Nowakowski等[10]用流式细胞术检测MM患者CMC并结合新的多发性骨髓瘤ISS分期系统分析对预后的影响，发现CMC的多少能直接影响患者的生存期，它与新ISS分期系统有很好的一致性;CMC结合MM新的ISS分期是一个更稳定客观可靠的评估系统，有着独特的临床应用前景。Dingli等[11]用流式细胞术检测了246例相同的大剂量化疗方案诱导后接受异基因造血干细胞移植的MM患者在干细胞采集前2周内的CMC，将存在CMC作为高风险指标，并设定正常人群为对照组。结果二组之间在异基因移植后达到CR相差无几，但总体生存率和移植后持续缓解时间相差很大(58.6月vs 33.2月，20.4月 vs 14.1月)，但未见关于MMC与CMC表达的相关性及对与其它预后因素相关性的报道。国外有学者在MM的MC表型研究中认为：CD45在浆细胞的分化过程中表达逐渐减弱，在有增殖能力的幼稚浆细胞上有CD45高表达，在相对静止的浆细胞上表达很低。MC表达CD56，正常浆细胞不表达CD56，还认为CD56的高表达与疾病的侵袭性有关[13]。CD138 表达于MM患者骨髓和外周血恶性浆细胞，但随着MC凋亡，细胞表面的CD138 表达缺失，故Aref等[13]认为，可将CD138 作为观察活的肿瘤细胞数量变化的标志之一。正常浆细胞CD19+，CD19-是恶性浆细胞的明显特征[14]。因此，我们用CD19-、CD45+、CD56+、CD138+表达细胞作为恶性浆细胞。我们研究的患者中位发病年龄为58.5岁，D-S分期的百分比与Garcia-sanz等[8]报道的相似。检测到瘤细胞的A、B、C 3组包含了全部的初发及复发/难治患者，未检测到瘤细胞的D组都是PR、CR患者;A、B、C 3组的骨髓原浆细胞的中位百分比、β2-MG中位值 、LDH中位值 及肾功能患者的例数等也明显高于D组。研究发现在初发及复发/难治组和PR组的患者之间CMC、MMC的水平都存在着明显的统计学差异，CMC和MMC之间存在明显的相关性。这些发现证明CMC和MMC之间有很好的一致性，直接反映了病情的进展。在A组中CMC表达的百分比要比MMC的百分比低得多，这可能和CMC的低增殖率特性及外周血中促进增殖细胞因子浓度低下、不存在提供滋养的骨髓间充质细胞及恶劣的生长环境有关[15]。CMC/MMC阳性与阴性组之间的β2-MG、Alb及肾功能3个预后因数存在明显的统计学差别。但骨髓浆细胞染色体异常与是否检测到瘤细胞无明显相关性(P>0.05)。有文献报道，在染色体核型异常中，只有13号染色体缺失、14号染色体易位及亚二倍体等染色体异常是肯定的负性预后因素，但多倍体等异常则对病情进展影响小，预后相对较好[16]，因为在我们研究的病例中骨髓染色体异常的例数较少，统计时没有在染色体异常中排除这一因素。另外A组中初发及复发/难治患者占84.62%，比其它3组明显高，而且C组中初发及复发/难治患者比B组也要高(分别是50%，46.15%);在A、B 二组中，β2-MG、Alb及肾功能等3项指标均有明显的统计学意义。这一结果表明高CMC比MMC对病情的进展影响更大，其原因可能与CMC具有更强的迁移浸润能力有关，因此我们同意国外学者相关报道的结论[9]，这可能是CMC和MMC之间存在生物学差异，而这种差异可能与细胞表面的黏附分子的改变及形成新的信号通路异常等有关，有关这个问题需要进一步研究证实。由于目前研究的病例数尚少，需要对更多同时存在CMC和MMC的病例进行进一步的相关研究，特别是对生存期的影响。总之，从目前的研究结果看来，MM患者的CMC与MMC有明显的相关性。用流式细胞术同时检测到MM患者有CMC和MMC，则明确地显示肿瘤的负荷及其疾病的进展情况，而这一点有着重要的临床意义。

　　【参考文献】

　　1张之南,主编. 血液病诊断及疗效标准. 第2版. 北京:科学出版社; 1998：373-380

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　　4 吴雨洁, 李建勇, 仇海荣等. 四色流式细胞分析骨髓异常增生综合征原始细胞免疫表型. 中国实验血液学杂志, 2006; 14: 50-53

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　　10Nowakowski GS, Witzig TE, Dingli D, et al. Circulating plasma cells detected by flow cytometry as a predictor of survival in 302 patients with newly diagnosed multiple myeloma. Blood, 2005; 106: 2276-2279

　　11Dingli D, Nowakowski GS, Dispenzieri A, et al. Flow cytometric detection of circulating myeloma cells pretransplant in patients with multiple myeloma: a simple risk stratification system. Blood, 2006; 107: 3384-3388

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　　16 Gutierrez NC, Garcia JL， Hernandez JM, et al. Prognostic and biologic significance of chromosomal imbalances assessed by comparative genomic hybridization in multiple myeloma. Blood, 2004; 104: 2661-2666.