供者自然杀伤细胞减轻GVHD并提高移植成活率的实验研究

　　作者：黄纯兰,刘霆,陆晓茜,孟文彤　　作者单位：

　　【摘要】本研究观察激活的供、受者NK细胞能否减轻骨髓移植后GVHD和增加移植成活率。以C57BL/6小鼠作为供者，将接受6.5 Gy 60CO γ射线全身照射的BALB/c受鼠随机分为4组，对照1组(无任何处理)、对照2组(骨髓移植)、实验1组(骨髓移植同时输注激活的受者NK细胞)和实验2组(骨髓移植同时输注激活的供者NK细胞)，观察每组小鼠的活存期、嵌合率、GVHD临床和病理改变。结果表明：对照1组全部活存，实验1组比对照2组活存期短(P<0.05)，实验2组比对照2组活存期延长(P<0.01)。实验1 组GVHD临床及病理评分高于对照2组(P<0.05)，实验2组 GVHD临床及病理评分明显低于对照2组(P<0.01)。实验1组和实验2组嵌合率均较对照2组高(P<0.05)，实验2组的嵌合率比实验1组明显增加(P<0.01)。结论：激活的供者NK细胞能延长实验小鼠的活存期，降低GVHD严重程度，增加移植成活率;而激活的受者NK细胞却缩短实验小鼠的活存期，加重GVHD严重程度。受者NK细胞也增加移植成活率，但比供者NK细胞作用小。

　　【关键词】 骨髓移植;NK细胞;GVHD;移植成活率

　　Experimental Study of Donor Natural Killer Cells Reducing Graft-versus-host Disease and Enhancing EngraftmentHUANG Chun-Lan, LIU Ting, LU Xiao-Xi, MENG Wen-Tong　Department of Hematology, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, China

　　AbstractThe purpose of this study was to investigate whether pretransplant infusion of reactive natural killer cells(NK cells)from donor or recipient can reduce graft-versus-host disease(GVHD)and enhance engraftment in bone marrow transplantation(BMT). Recipient BALB/c mice were divided into 4 groups after received 6.5 Gy total-body irradiation (TBI): control group 1 was treated with nothing, control group 2 received BMT alone, experiment group 1 received BMT and autoreactive NK cells, experiment group 2 received BMT and alloreactive NK cells. Life span, clinical and pathologic changes of GVHD and chimerism rate of each group were evaluated. The results showed that all mice were survival in control group 1. The life span was shorter in experiment group 1 than that in control group 2 (P<0.05)and longer in experiment group 2 than that in control group 2(P<0.01). GVHD was higher in score of experiment group 1 than in control group 2 (P<0.05)but lower in experiment group 2 than that in control group 2(P<0.01). The donor chimerism rate in both two experiment groups were higher than that in control group 2 (P<0.05), however, the donor chimerism rate was higher in experiment group 2 than that in experiment group 1(P<0.01). It is concluded that pretransplant infusion of alloreactive donor NK cells can prolong life span, reduce the degree of GVHD and enhance engraftment. But autoreactive recipient NK cells can shorten life span, aggravate the degree of GVHD and also enhance engraftment, which is weaker than that using alloreactive donor NK cells.

　　Key wordsbone marrow transplantation; natural killer cell; GVHD; engraftment

　　骨髓移植是目前根治恶性血液肿瘤的主要方法，但其主要致死性并发症——移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)却制约着其应用。回顾性研究发现,在骨髓移植中受者体内天然杀伤细胞(natural killer cells, NK)增加的同时GVHD发生率降低，移植成活率增加，复发率减少[1]。我们利用动物模型分别研究了供、受者来源的NK细胞能否减轻GVHD和增加移植成活率，探索NK细胞在骨髓移植中的应用及机制。

　　材料和方法

　　实验动物

　　C57BL/6(H-2b)小鼠作为供者，BALB/c(H-2d)小鼠作为受者，均为雄性，鼠龄8周，体重18-20 g，均为清洁级动物(四川大学华西校区实验动物中心提供和饲养)。

　　实验分组

　　将接受6.5 Gy 60CO γ射线全身照射的BALB/c受鼠随机分为4组：对照1组(不予以任何处理)、对照2组(予以骨髓移植)、实验1组(骨髓移植同时输注激活的受者NK细胞)，实验2组(骨髓移植同时输注激活的供者NK细胞)。每组用10只小鼠观察生存期和GVHD，用20只小鼠检测嵌合率。

　　NK细胞分离、纯化、检测及体外活化

　　分别取供、受鼠脾脏和骨髓细胞，用抗CD49b(DX5)MicroBeads(Miltenyi Biotec公司产品)分离NK细胞，用rhIL-2体外培养及激活，标记CD49b抗体(BioLegend公司产品)，用流式细胞仪(Coulter公司产品)检测NK细胞含量。LAC-1细胞作为靶细胞，MTT法检测培养后的NK细胞杀伤活性。

　　小鼠骨髓移植模型

　　参照Ruggeri等[2]的方法，各组受鼠在移植前饮用含庆大霉素灭菌水(32×104 U/L)，移植前1天行亚致死剂量60CO γ射线全身照射(TBI 6.5 Gy)。照射后4小时在无菌条件下，用头皮针沿受鼠鼠尾静脉输注含量大于90%、活细胞数大于95%、杀伤活性大于90%的NK细胞(5×105/只)。照射后1天，无菌条件下摘眼处死供鼠，取股骨，用无菌培养液冲洗骨髓腔，收集细胞冲洗液，溶解红细胞后，作为移植的骨髓细胞。取供鼠脾脏，研磨后用200目筛网制成单个细胞悬液，溶解红细胞后，作为输注的供鼠淋巴细胞。在无菌条件下，用头皮针沿受鼠鼠尾静脉输注供鼠骨髓细胞(1×107/只)和供鼠淋巴细胞(1×107/只)。术后于二级动物房层流床饲养。

　　存活期和GVHD临床表现的观察

　　活存超过30天为长期活存[3]。移植后，每周称重1次，观察小鼠有无体重下降、腹泻和脱毛，有无弓背、耸毛、活动度差等精神表现。GVHD临床评分(0-10分)由体重下降、活动度、姿势、耸毛、皮肤溃疡5项相加组成。体重下降<10%为0分，下降10%-25%为1分，下降>25%为2分。无活动度下降、姿势异常、耸毛为0分，轻度活动度下降、耸毛、姿势异常判为1分，重度活动度下降、耸毛、姿势呈弓背样改变为2分。皮肤完整无脱毛为0分，小片浅溃疡、轻度溃疡为1分，大片溃疡、脱毛为2分[4]。

　　GVHD病理学观察

　　对死亡小鼠及活存超过30天处死的小鼠，取肝、脾、肠和皮肤组织，用4%的多聚甲醛液固定，石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察。GVHD病理评分标准(0-10分)：肝脏根据汇管区有无淋巴细胞浸润、胆管有无炎症、阻塞分为Ⅰ-Ⅴ级;小肠按有无隐窝细胞坏死、粘膜缺失分为Ⅰ-Ⅴ级[5]。

　　嵌合体检查

　　从死亡小鼠以及移植前和移植后1、2、3、4周各组处死的小鼠中，取出脾脏并研磨，溶解去掉红细胞。用FITC连接的供鼠MHCⅠ单克隆抗体(H-Kb抗体)和PE连接的受鼠MHCⅠ单克隆抗体(H-Kd抗体)标记，上流式细胞仪检测嵌合率。

　　统计学分析

　　采用SPSS 10.0统计软件包处理，计量资料用均数±标准差(X±SD)表示，计数资料用百分率(%)表示。用单因素方差分析(one-way ANOVA)对各组均数作显著性检验，如多组比较有显著性差异，进一步采用Student-Newmen-Keuls test作各样本之间的两两比较。等级资料用秩和检验。对小鼠生存期绘制Kaplan-Meier存活曲线，用时序检验和log-rank test检验比较生存期及死亡率。

　　结果

　　生存期及死亡率观察

　　对照1组全部存活，对照2组、实验1组、实验2组存活期分别为25.6±1.2天、19.4±1.8天和33.7±1.5天，30天死亡率分别为100%、100%和20%。各组Kaplan-Meier生存率曲线见图1。实验2组和对照2组差异显著(χ2=13.5，P=0.0002)。实验1组和对照2组差异显著(χ2=4.94，P=0.03)。

　　GVHD临床表现

　　对照1组没有GVHD临床表现。对照2组和实验1组出现明显GVHD临床表现：体重下降明显(下降10%-25%)、活动度降低、弓背体位、耸毛、脱毛、腹泻等现象，评分分别为7.2±1.3和8.5±1.0分;两组比较有差异(H值=-2.09，P=0.037)。实验2组GVHD出现晚(25天后才出现)、程度轻，表现为轻度体重下降(下降<10%)、轻度脱毛和弓背体位，活动度轻度降低，没有腹泻，评分3.1±1.2分，与对照2组比较有显著差异(H值=-3.766，P=0.0000)(表1)。Table 1. Scored severity of GVHD manifestation in groups (略)

　　GVHD病理表现

　　对照1组小鼠肝、脾、肠和皮肤组织均正常。对照2组和实验1组小鼠肝脏结构被破坏，肝细胞索排列紊乱，肝细胞弥漫性大片坏死，中央静脉和肝血窦扩张、淤血，胆小管增生、淤胆，坏死区由增生的结缔组织所取代，伴大量枯否氏细胞和淋巴细胞浸润。小肠粘膜层被覆上皮坏死脱落，为一层红染的坏死组织、变性的白细胞和纤维素交织成的假膜所覆盖;粘膜和粘膜下层明显水肿、充血，伴大量淋巴细胞浸润。脾脏萎缩，正常结构破坏，有巨噬细胞和淋巴细胞浸润。皮肤结构破坏，局部有淋巴细胞浸润，有纤维细胞增生。评分分别7.5±1.1和8.8±1.0分，两组比较有差异(H值为-2.330，P=0.020)。实验2组小鼠肝细胞排列整齐，形态完整，肝血窦和汇管区有少量枯否氏细胞和淋巴细胞浸润，中央静脉轻度淤血。小肠各层结构完整，没有坏死脱落，粘膜和粘膜下层伴少量淋巴细胞浸润。脾脏结构正常，没有巨噬细胞和淋巴细胞浸润。皮肤仅见真皮层毛细血管轻度扩张，未见淋巴细胞浸润。评分2.5±1.1分，与对照2组比较差异显著(H值为-3.808，P=0.0000)(表2和图2)。Table 2. Scored severity of GVHD pathology feature in groups (略)

　　嵌合体检查

　　对照1组没有供者嵌合体，对照2组、实验1组、实验2组在第2周供者嵌合率最高，分别为63.2%、81.7%、96.4%，以后逐渐下降，第4周供者嵌合率分别为3.7%、29.4%、52%(P<0.05)(图3)。

　　讨论

　　单纯照射组全部存活，说明我们使用的是亚致死剂量照射，实验动物均能耐受预处理，其他组小鼠死亡可以排除照射原因。由于没有移植供鼠骨髓，单纯照射组病理检测无GVHD改变，也没有供者嵌合体。我们采用骨髓移植联合输注供鼠淋巴细胞，在单纯骨髓移植组均出现了严重的GVHD临床和病理改变，构建了异基因骨髓移植GVHD模型;由于使用的是亚致死剂量照射预处理，其嵌合率最高为63.2%，4周时下降到3.7%，移植物被排斥。该模型被用于进一步研究NK细胞对GVHD的作用。输入激活的供者NK细胞能克服移植物被排斥，使嵌合率高达96.4%，4周时保持52%，增加了移植成活率。同时GVHD并没有加重，反而明显减轻，从7.2分降到3.1分，生存期从25.6天延长到33.7天，该结果与国外研究结果一致[2]，说明激活的供者NK细胞能延长生存期，降低GVHD临床及病理程度，增加嵌合率，为临床减少GVHD和提高移植成活率提供了切实可行的新思路和新方法。NK细胞具有两种不同的受体，一种是激活NK细胞杀伤作用的受体(KAR)，另一种是抑制NK细胞杀伤作用的受体(KIR)。如果KIR与其配体MHCⅠ不匹配，NK细胞将破坏含有这种配体的细胞[6]。我们使用C57BL/6(H-2b)和BALB/c(H-2d)两个不同品系的近交系小鼠，它们的NK细胞KIR基因和MHCⅠ基因是不同的，供鼠KIR与受鼠MHCⅠ不匹配，供鼠NK细胞会杀伤受者细胞，比如杀伤受者抗原递呈细胞等。因为自体NK细胞和自身MHCⅠ是匹配的，不会杀死自身细胞，所以我们将自体NK细胞设为异体NK细胞的对照。结果激活的自体NK细胞加重GVHD，小鼠死亡时间从25.6天缩短到19.4天，但嵌合率却增加，对此，目前还没有类似结果报道。这些结果不能完全用KIR- MHCⅠ的匹配关系解释。是否自体NK细胞激活后其KAR功能和活性发生了变化，KAR杀伤作用远远大于KIR的抑制作用，误杀了自身正常组织，从而加重GVHD。有报道体外NK细胞能溶解同源性未成熟树突状细胞(iDC)[7]，由于iDC起免疫抑制作用，自体NK细胞溶解自体iDC，也可以解释自体NK细胞加重GVHD。我们的研究结果显示，采用供鼠激活的NK细胞能够减轻急性GVHD的严重程度，并且促进供鼠骨髓植入。其原理可能与供鼠NK细胞对受鼠体内抗原呈递细胞、淋巴细胞、吞噬细胞的杀伤和抑制作用有关，供鼠NK细胞在GVHD发病中对抗原识别和细胞效应阶段的这种生物调控作用，值得进一步深入研究。

　　【参考文献】

　　1 Davies SM, Ruggieri L, DeFor T, et al. Evaluation of KIR ligand incompatibility in mismatched unrelated donor hematopoietic transplants. Blood, 2002; 100: 3825-3827

　　2 Ruggeri L, Capanni M, Urbani E, et al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science, 2002; 295: 2097-2100

　　3段连宁，郭坤元，袁进等.同种异基因Th2细胞移植对GVHD和GVL效应的作用.中国实验血液学杂志, 2000; 8：57-60

　　4 Bryson JS, Jennings CD, Lowery DM,et al. Rejection of an MHC class II negative tumor following induction of murine syngeneic graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplant, 1999; 23: 363-72

　　5 Cooke KR, Kobzik L, Martin TR,et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation:I. the roles of minor H antigens and endotoxin. Blood,1996; 8: 3230-3239

　　6 Young NT. Immunobiology of natural killer lymphocytes in transplantation. Transplantation, 2004; 15, 78:1-6

　　7 Cooper MA, Fehniger TA, Fuchs A, et al. Nk cell and DC interactions. Trends Immunol, 2004; 25: 47-52.