肝脾γδ T细胞淋巴瘤及其与EB病毒感染的关系

　　作者：高晓宁　唐锁勤　刘英　王建文　　作者单位：中国人民解放军总医院小儿内科，100853北京

　　【摘要】为探讨肝脾γδ T细胞淋巴瘤的临床及病理特点及其与EB病毒感染的关系，对1例9岁女性肝脾γδ T细胞淋巴瘤的患者进行了临床观察，采集骨髓液涂片行瑞氏染色，骨髓活检和肝脏活检的组织切片后常规化学染色及免疫组织化学标记，用EB病毒寡核苷酸探针(EBER)原位杂交。结果显示，患儿长期发热、贫血、血小板减低，肝脾进行性肿大，伴慢性活动性EB病毒感染，血清乳酸脱氢酶、铁蛋白呈进行性增高，多形性小淋巴细胞浸润骨髓基质，肝内增生浸润的淋巴细胞强表达T细胞标记物CD3和活化细胞毒性标记物粒酶 B，EB病毒mRNA阴性。结论：肝脾γδ T细胞淋巴瘤具有独特的临床和组织病理特征，肝脏和(或)脾脏和(或)骨髓病理检查及免疫表型分析有助于诊断;EB病毒感染可能是γδ T细胞发生恶性转化后的晚期事件。

　　【关键词】 肝脾γδT细胞淋巴瘤　EB病毒感染　淋巴瘤

　　Hepatosplenic γδ T Cell Lymphoma and Its Relationship with Epstein-Barr Virus Infection　GAO Xiao-Ning, TANG Suo-Qin, LIU Ying, WANG Jian-Wen　Department of Pediatrics, The General Hospital of PLA, Beijing 100853 , China

　　AbstractTo explore the clinical and pathological characteristics of hepatosplenic γδ T-cell lymphoma and its relationship with Epstein-Barr virus infection, the clinical features of a 9-year-old girl with hepatosplenic γδ T-cell lymphoma were investigated, the smears of bone marrow was stained with Wright′ s stain, biopsies of bone marrow and liver specimen were embedded in plastic and sliced about 4 μm in thickness and routinely stained with HE staining, the immunohistochemical staining was used to mark the tumor cells, and EBER probes were used to detect Epstein-Barr virus RNA. The results showed that the girl presented with prolonged fever, anemia, thrombocytopenia, hepatosplenomegaly, chronic active Epstein-Barr virus infection, and elevated levels of serum ferritin and lactate dehydrogenase. Bone marrow aspirate revealed the infiltration of atypical lymphocytes in the bone marrow stroma. The liver biopsy specimen revealed the infiltration of lymphocytes in the sinusoids, which was positive for the T-cell associated marker CD3 and activated cytotoxicity-associated marker granzyme B. In-situ hybridization analysis with EBER probes revealed that the above-mentioned characteristics were negative in neoplastic cells. It is concluded that hepatosplenic γδ T-cell lymphoma is a disease with distinctive clinical, histopathologic, and phenotypic characteristics. Hepatic and/or splenic and/or bone marrow biopsy with combined phenotype is beneficial to diagnosis. Epstein-Barr virus infection is late event involving an already transformed gammadelta T-cell clone.

　　Key wordshepatosplenic γδ T cell lymphoma; Epstein-Barr virus infection; lymphoma

　　肝脾γδ T细胞淋巴瘤(hepatosplenic γδ T cell lymphoma，HSγδ TCL)是γδ T细胞克隆性增殖导致的临床过程呈侵袭性的恶性疾病，由Farcet等[1]在1990年首先描述，他们通过仔细分析以前的2例主要浸润肝脏和脾脏的外周γδ T细胞淋巴瘤的病例，认定该肿瘤是一种特殊类型淋巴瘤。在1994年的REAL分类和1999年的WHO分类中，将其作为一种独立的病理类型，归为外周T细胞淋巴瘤。至今国内外文献有大约60余例的病例报道，其中大多数是青年，儿童罕见。15岁以下的儿童病例国外报道仅有6例[2-7]，国内仅1例[8]。肝脾γδ T细胞淋巴瘤具有很多非特异的症状，因此在一些病例中的诊断比较困难，在儿童更是由于该病的罕见而很少能做出诊断。我院2005年收治了1例9岁女性肝脾γδ T细胞淋巴瘤患儿，本研究对其临床及病理特点及其与EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染的关系进行探讨，以提高对此病的认识。

　　材料和方法

　　临床资料

　　我院收治的1例肝脾γδ T细胞淋巴瘤儿童病例。患儿为9岁女孩，以反复发热、肝脾进行性肿大起病，病程1年半。患儿2004年5月因发热在当地医院检查发现肝脾肿大伴肝功能异常，体温最高为39℃，伴咽痛、腿痛、乏力，无咳嗽、吐泻、皮疹、出血点。骨髓形态学未见异常，乙肝病毒血清学标志物阴性。予以抗病毒、抗菌、保肝治疗2周后热退出院，但仍有肝脾肿大、间断发热，肝功能异常。2005年1月在外院行肝脏穿刺活检病理示：肝组织中等量炎细胞浸润，免疫组织化学检测显示：CD68+、CD3+、少量CD20+;病理诊断：非嗜肝病毒性肝炎、病原待定;生化检查示谷丙转氨酶181 U/L，谷草转氨酶145 U/L，乳酸脱氢酶469 U/L;甲乙丙丁戊肝病毒血清学标志物均为阴性，梅毒、艾滋病抗体阴性;T淋巴细胞亚群CD4/CD8 0.22;铜蓝蛋白、铜氧化酶正常;自身抗体阴性。按“病毒性肝炎，病原待定”予以保肝治疗，无明显好转。2005年4月再次因发热在外院住院，查EBV-IgG+，EBV-CA-IgG+，EBV-EA-IgG+， EBV-NA-IgG+，CMV-IgM-，单纯疱疹病毒-IgM-，柯萨奇病毒-IgM-，埃可病毒-IgM-，按“慢性活动性EB病毒感染”予以抗病毒、保肝治疗后热退出院。2005年9月复查EBV-IgG滴度1∶2 560，肝功能、血清乳酸脱氢酶、血清铁蛋白均正常;骨髓像偶见异常淋巴细胞;腹部CT显示肝实质密度减低，脾下极可见小片状低密度影，肝门、腹腔内和肠系膜根部有肿大淋巴结。2005年9月14日至11月8日按“慢性活动性EB病毒感染”给予“长春新碱、足叶乙甙、强的松”治疗，同时给予“丙种球蛋白、干扰素”调节免疫;治疗2周后评估病情，血清乳酸脱氢酶正常，血清铁蛋白轻度升高，腹部CT显示肝不大，脾缩小，脾下极小片状低密度影消失，肿大淋巴结消失，提示治疗有效;但治疗5周后评估病情，血清乳酸脱氢酶正常，血清铁蛋白继续升高，肝功能开始异常，骨髓象出现分类不明细胞，占0.5%，胞体偏小，胞浆偏于一侧，有拉尾现象，核染色质粗，核仁不清晰，疑为病毒相关细胞，腹部CT变化不明显;治疗8周后又评估病情，血清乳酸脱氢酶、血清铁蛋白和肝功能继续增高，腹部CT显示脾脏较前增大，肝实质密度较前减低，患儿持续弛张高热，提示病情进展。2005年11月22日来我院就诊并收治入院。

　　骨髓活检及染色

　　用改良的GMH88-01型骨髓活检针，在髂骨取骨髓组织，标本取出后立即放入Bouin固定液，固定1小时后，进行脱水、浸泡、塑料包埋、半薄切片，做常规HE染色。同时取骨髓液及外周血涂片行计数和瑞氏染色镜检。观察骨髓和外周血涂片中瘤细胞的形态及细胞比值情况。观察瘤细胞受累骨髓组织病理学变化。

　　肝脏组织免疫组织化学染色

　　为明确诊断，重新对患儿2005年1月肝穿活检组织进行了病理学检查。石蜡包埋肝脏穿刺组织切片，厚4 μm，采用标准的SABC(链菌素-卵白素生物素)法进行染色，所用抗体CD3ε、granzyme B、Ki67、CD20、CD56、CD8均购于Dako基因公司。切片脱蜡至水，微波抗原修复(0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液，700 W，5分钟2次，自然冷却至室温)。一抗4℃过夜，DAB显色。

　　EB病毒原位杂交

　　为分析肝脏浸润肿瘤组织EB病毒是否存在，选用荧光素标记的EBV编码的小mRNA探针(EBER，购自Dako基因公司)。主要步骤详见文献[9]。

　　结果

　　病例临床特点及实验室检查结果

　　患儿为女性，9岁，以长期发热、肝脾进行性肿大起病，伴有慢性活动性EB病毒感染病史，入院时查体肝、脾明显肿大，而无明显淋巴结肿大，实验室检查有三系血细胞减少，血清乳酸脱氢酶、铁蛋白进行性增高。

　　骨髓形态学检查及骨髓活检结果

　　骨髓象有核细胞减少，以淋系为主占52.5%，偶见异常淋巴细胞(占1.5%)，淋巴细胞有拉尾现象，粒系占46%，其中幼粒(30%)/成熟粒(15%)居多，有病态造血;胞体大小悬殊，核分叶不良，巨形幼粒，多为黄沙样颗粒，偶见双色性颗粒，红系缺如，可见巨核和裸巨核，血小板不少，可见吞噬细胞(含淋巴细胞)。骨髓活检：多形性小淋巴细胞间质性及局灶性浸润基质，正常造血细胞生成可见(附图)。考虑：恶性淋巴瘤骨髓受累。

　　肝脏组织病理学及免疫组织化学表现

　　肝细胞肿胀，见中央静脉及肝窦扩张，有17个转化淋巴细胞浸润灶，部分在汇管区内，部分在肝实质内，细胞体积中等偏小，胞浆不显，核不规则有核分裂像，浸润细胞体积明显大于正常淋巴细胞，肝窦内尚见转化淋巴细胞，高度怀疑肿瘤性增生，未见转化B细胞。免疫组织化学检测显示：CD3+、粒酶(granzyme) B+、Ki67+个别，CD20-、CD56-、CD8-。考虑可能为肝脾γδT细胞淋巴瘤(附图)。

　　EB病毒检查结果

　　经EBER原位杂交显示肝脏浸润肿瘤组织EB病毒阴性。

　　讨论

　　肝脾γδ T细胞淋巴瘤主要发生于青年，中位发病年龄在34岁[10]，多见于青年人，男性明显多于女性，男女之比为9∶1。在儿童非常罕见，国外报道的15岁以下儿童仅6例，其中男孩4例，女孩2例，国内报道1例4岁女孩。该病多发于接受器官移植的患者，提示发病与免疫功能抑制有关[10]。临床表现有显著肝脾肿大，但淋巴结很少受累。常见发热、体重减轻、腹痛和衰弱等全身症状。外周血全血细胞减少，血小板量显著减低。肿瘤细胞主要累及肝、脾、骨髓[11]。病理检查、肿瘤细胞免疫表型分析有助于诊断。在肝脏，肿瘤细胞沿着肝窦浸润，不破坏肝细胞，汇管区病变一般不明显，个别可有轻度汇管区浸润;在脾脏，肿瘤细胞弥漫地浸润在脾脏红髓中，使红髓扩大，窦内、髓索均可浸润，窦部浸润更明显，白髓不受累;在骨髓，可见到不典型的中等大小的淋巴细胞，核轻度不规则，染色质较松散，有中等量的嗜碱性胞质，见不到嗜苯胺蓝颗粒，骨髓活检示肿瘤细胞在间质和窦隙中呈小丛状浸润，或者为单个散在浸润。γδ T细胞淋巴瘤细胞多为CD4-、CD8-、CD3+、TCRγδ+，大部分表达CD2和CD7，但是CD5-还可表达NK细胞相关抗原(CD16、CD56)、细胞毒性相关分子(穿孔蛋白、粒酶B、FasL、TIA-1)[12]。在诊断上需要与其他造血系统疾病鉴别，如传染性单核细胞增多症、侵袭性NK细胞白血病/淋巴瘤、淋巴母细胞白血病、毛细胞白血病等。本病进展快，预后差，中位生存时间8-10个月[13]。单一药物化疗效果不好，联合用药多采用CHOP方案，但常常由于早期复发而失败。有报道1例10岁男孩经3疗程ICE方案(异环磷酰胺，卡铂，足叶乙甙)和3疗程BEAM方案(卡莫司汀，足叶乙甙，阿糖胞苷，马法兰)化疗后接受异基因造血干细胞移植，移植后无病生存期已超过1年[5]。因此，早期诊断，寻找合适配型，实施在造血干细胞移植支持下的大剂量化疗有望延长生存期。本例患者为9岁女孩。有发热、肝脾肿大，外周血三系细胞减少;影像学显示肝影密度减低，脾下极有小片状低密度影;血清乳酸脱氢酶、铁蛋白进行性增高，骨髓表现为病态造血和淋巴细胞增殖，骨髓活检示多形性小淋巴细胞浸润基质;肝穿刺病理检查提示单克隆增生，表达T细胞标记物及活化细胞毒性颗粒，不表达B系标记。支持肝脾γδ T细胞淋巴瘤诊断。关于EB病毒在肝脾γδ T细胞淋巴瘤发生过程中所起的作用，各报道结论不一。有人认为，EB病毒感染的存在对肿瘤发生可能起着一种重要的启动作用， Ohshima等[12]采用EBER探针原位杂交技术分析了3例没有免疫缺陷的肝脾γδ T细胞淋巴瘤患者的肿瘤细胞，EBER原位杂交检测到EB病毒RNA有强表达，其中2例还检测到EB病毒末端重复序列克隆带。因为抗原刺激可以影响γδ T细胞的激活和(或)细胞因子[14]，推测EB病毒可能通过诱导细胞活化在肝脾γδ T细胞淋巴瘤的发病中发挥作用。但也有人持完全相反意见，认为EB病者感染与肿瘤发生无关，Roncella等[15]分析了1例肾移植术后6年发生自发性脾破裂，肝脾病理检查确诊为肝脾γδ T细胞淋巴瘤的病例，脾脏的单核细胞可以检测到EB病毒，但是EBER-1原位杂交显示仅有少部分恶性淋巴细胞(5%-7%)受EB病毒感染。因此认为EB病毒感染是γδ T细胞发生恶性转化后的晚期事件。本病例虽在病程中伴随EB病毒抗体持续高滴度，但是肿瘤细胞中EB病毒阴性，故推测，本例EB病毒感染很可能出现在肿瘤发生后，仅仅是一种伴随现象。对此，有必要对更多样本进行研究加深认识。

　　【参考文献】

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