新生小鼠心肌干细胞培养与分化的研究

　　作者：李妍,陆东风,张莉,杨镇军　　作者单位：广州医学院第二附属医院 心内科，广州 510260

　　【摘要】目的了解新生小鼠心肌干细胞原代和传代的培养及其分化潜能，为缺血及坏死心肌重建的临床应用提供科学依据。方法 在无菌超净台中剪取新生小鼠心脏组织，经胰酶反复消化后，弃去消化液，所得剩余组织块用胶头滴管反复吹打后离心，加入培养液培养，待其长满培养瓶后进行传代，传代培养约1周可见搏动的心肌细胞，也可见成团细胞的同步收缩。结果 采用改良后的方法从消化后的心肌组织块中成功培养得到原代细胞，进行免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定其表型为ckit、sca1阳性的细胞，表面不表达CD 34、CD 8、肌球蛋白重链(MHCⅡ)。细胞经传代培养1周左右，开始出现搏动，也可见成团细胞的同步收缩。再次经免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定其表型为ckit、sca1阴性，MHCⅡ阳性的细胞，仍然不表达CD 34、CD 8。结论 在原方法的基础上，通过对其进行改良，从心脏中成功分离得到纯度更高、活性更好的心肌干细胞，其表型为ckit+、sca1+、CD 34-、CD 8-、MHCⅡ，经过传代培养之后，分化为搏动的心肌细胞，细胞表面标记变为ckit-、sca1-、CD 34-、CD 8-，并表达心肌结构蛋白MHCⅡ。

　　【关键词】 心肌干细胞; 心肌再生; 心肌缺血

　　以往的观念认为，成年心脏属于终末分化器官。一旦心脏受到损伤，将无法通过自身细胞的再生获得完全的修复，而只能通过肥大等重构方式代偿。而随着PCNA, Ki 67, Brd U等与增殖相关的抗原、标记物的应用，实验证明心肌细胞存在有丝分裂，且在心肌缺血、坏死、心衰等情况下，细胞增殖活跃。提示心脏内也可能存在着心肌干细胞[1,2]。成体心脏内存在具有特异性心肌分化潜能的多能干细胞，即成体心肌干细胞(cardiac stem cells， CSCs)是存在于发育成熟机体心脏组织中的具有高度自我更新和特异性心肌分化、增殖潜能的未分化细胞。但是，由于目前还不能从形态上识别心脏本身来源的干细胞,对其的鉴定、分离纯化只能通过其表面标志进行。本实验通过从小鼠心肌中分离培养出心肌干细胞，并对其表型进行鉴定、分析。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与试剂 购自广东省实验动物中心的昆明小鼠(雄鼠4只，雌鼠16只)。于动物房饲养并观察1周后，即行配种。配种成功约4~6周后，陆续产出新生鼠，取1~2 d新生鼠用于实验。FITC antimouse sca1、PE antimouse CD 117、PE Cy 5 antimouse MHC class Ⅱ、FITC antimouse CD 34、PE antimouse CD 8 均购自ebioscience公司。

　　1.2 心肌干细胞的培养与传代 将刚出生的小鼠置于75% 酒精内消毒后剪取心脏，立即置于预先加入DPBS液的培养皿中，剪成约0.5～1 mm3的组织块，用DPBS液反复冲洗。然后加入0.2%胰酶2～3 ml，37oC，5%CO2恒温水浴培养箱中消化5 min，弃去消化液，重复3次。加入少量CEM培养液(成份：IMDM，10%胎牛血清，100 u/ml青霉素G，100 μg/ml链霉素，2 mmol/L L谷氨酰胺，0.1 mmol/L 2巯基乙醇)终止消化反应，用吸管反复吹打组织块，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入CEM培养液至培养皿中，用吸管轻轻将其吹打成组织块悬液，再将悬液吸出移入培养瓶中，于37oC，5%CO2恒温水浴培养箱中培养。约24 h后于倒置显微镜下可观察到组织块已经贴壁，并且可以观察到从其周围爬出小而圆的细胞，2～3 d换液1次，观察细胞生长情况。约1周左右，细胞增殖至铺满整个培养瓶底，可进行传代，弃去培养液，用DPBS液清洗3次，加入TrypsinEDTA(0.25% tryspsin，1mM EDTA•4Na)于37oC消化约4 min，镜下可见细胞收缩变圆，立即加入少量CEM培养液终止反应。反复用吸管吸取瓶底液体轻轻吹打培养瓶壁，使贴壁细胞脱落形成细胞悬液。将悬液移至离心管，1 000 r/min离心5 min，弃去上清，得到传代后的细胞。将收集到的细胞用CGM培养液继续培养(成份：35% IMDM/65% DMEMHam’s F12，2% B27，10 ng/ml EGF，20 ng/ml bFGF，40 nmol/L cardiotrophin1，40 nmol/L thrombin，100 u/ml青霉素G，100 μg/ml链霉素，2 mmol/L L谷氨酰胺，0.1 mmol/L 2巯基乙醇)，每2～3 d换液1次。

　　1.3 免疫荧光法检测细胞 细胞原代或传代培养约1周左右，可采用前述方法制成细胞悬液，将细胞悬液移入24孔培养板加入培养液静置过夜，于倒置显微镜下观察细胞完全贴壁，弃去培养液，DPBS冲洗，滴加经稀释至染色效价如1∶8或1∶16的荧光抗体FITC antimouse sca1、PE antimouse CD 117 、PE Cy5 antimouse MHC class Ⅱ，在37℃染色45～60 min，DPBS震荡洗涤3次，蒸馏水震荡洗涤2次，滴加4%多聚甲醛固定，于共聚焦显微镜下观察细胞。

　　1.4 流式细胞仪鉴定细胞 组织块培养进行约1周左右，见细胞生长良好，可采用前述方法制成细胞悬液，取细胞悬液，台盼蓝染色后于细胞计数板上计数活细胞数，调整细胞浓度至106个/L，送流式鉴定。同时，选取传代时间约1周的细胞，同样配制成浓度为106个/L细胞悬液，送流式鉴定。鉴定的主要表面标志物有ckit (CD 117) 、sca1、CD 34、CD 8、MHCⅡ。所有标本及相应抗体均送至中山二院流式细胞室进行鉴定。

　　1.5 统计学处理 原代及传代培养的细胞经过流式细胞仪鉴定后，共进行8次，所得到的数据采用SPSS 11.0软件包进行统计学处理，表1使用的是配对样本的t检验，比较原代细胞与传代细胞表面标记物的差异;表2使用的是两样本的t检验，比较同一批培养的原代和传代细胞，分别使用原方法与改良后的方法，所得到的表面标记物的差异，以P<0.05为有统计学意义。

　　2 实验结果

　　2.1 共聚焦显微镜下免疫荧光细胞图像 免疫荧光染色证实，原代细胞表面带有sca1和ckit标记(图1，A为多数带有sca1标记的绿色荧光;B为多数带有ckit标记的红色荧光)。而大部分传代细胞表面并不带有sca1和ckit标记(图2，A为极少带有sca1标记的绿色荧光;B极少带有ckit标记的红色荧光)。传代细胞内带有MHCⅡ标记(图3为细胞内可见带有MHCⅡ标记的红色荧光)。

　　2.2 流式细胞仪结果分析图 对比研究传代细胞前后细胞表型的改变，检测的细胞标记有CD 34、CD 8、ckit、sca1、MHCⅡ。图1中A、B分别为原代细胞在流式细胞仪中ckit、sca1、MHCⅡ标志的表达图。图2中A、B分别为传代细胞在流式细胞仪中ckit、sca1、MHCⅡ标志的表达图。

　　2.3 统计结果分析 流式细胞仪结果图分析显示，原代细胞的表面标记为ckit+、sca1+、MHCⅡ-、CD 34-、CD 8-，经过传代培养之后，细胞表面标记变为ckit-、sca1-、MHCⅡ+、CD 34-、CD 8-(共8次，统计结果见表1)。将改良后的方法与原方法进行对比发现，新方法培养所得到的原代及传代细胞纯度均较高，活性较好对比分析结果见表2。表1 流式细胞仪结果统计分析表表2 流式细胞仪结果比较表

　　3 讨 论

　　有学者实验证明成年心脏内确实存在着具有多向分化潜能的干细胞[39]。他们所发现的心肌干细胞都具有以下基本特征：① 缺乏血细胞系、 骨髓造血干细胞、内皮祖细胞、成熟内皮细胞表型;② 具有克隆形成能力及自我更新能力;③ 可表达一系列心肌转录基因(GATA4， MEF2C，TEF1)，但不表达心肌结构基因(MHC ，MLC2a，MLC 2v，CTnT等);④ 不仅能在体外分化成可搏动的心肌细胞，而且将其注入心肌梗死区后也能在体内分化成心肌细胞，改善心脏功能，缩小梗死面积。我实验组已经从新生大鼠心肌组织中成功分离培养得到原代心肌干细胞，经流式细胞仪鉴定其表型为ckit+、CD 31+、CD 34-、CD 45-、CTnT-，细胞经传代并使用含CT-1，凝血酶等成份的培养液培养2周后，单个细胞开始出现搏动，亦可见成团细胞的同步收缩。再次流式鉴定的结果，表型有所改变ckit+、CD 31-、CD 34-、CD 45-、CTnT+。同时，免疫组化证实，细胞内有心肌细胞结构蛋白表达(CTnT)[10]。实验结果初步证实了心肌中成体干细胞的存在性。我们将原来使用的方法与改良后的方法进行比较，以前所使用的方法中仅仅是用眼科剪刀将大鼠心肌组织剪碎至0.5～1 mm3，此时的组织块仍然肉眼可见，同时将组织块用培养液润洗后，必须要等待组织块贴壁之后才能再添加培养液，而加入培养液后，已经贴壁的组织块又很容易再漂浮起来，使得贴壁的心肌组织相对比较少，而从周围爬出的细胞就更少了。经过不断的观察和实验，现在所采用改良后的方法是在用剪刀将大鼠组织块剪碎的基础上，经过胰酶消化后，再使用胶头滴管进行反复吹打、高速离心后，再加入培养液重悬后进行培养。经过上述方法处理的心肌组织块更小、更易贴壁，加入培养液后成为匀浆状，一般24 h后微小的组织块即可贴壁并可见从周围爬出细胞。实验将同一批培养的原代细胞，分别采用上述两种方法后，对其进行流式细胞仪鉴定分析，结果表面改良后的组织块培养法能够分离得到密度较大、纯度较高的ckit+ 、sca1+干细胞群，而且将两组细胞分别进行传代后，再进行鉴定，所得到的带有心肌结构蛋白MHC Ⅱ 标记的心肌细胞数量明显增多，同时活性也较高。由于各家报道的心肌干细胞分离与鉴定的方法与标记物的不同，我们采用众所周知的细胞表面标记来证明培养所得到的细胞。CD 34被认为是最重要的造血干细胞标记物, CD 8为成熟T淋巴细胞表面标记，而ckit为酪氨酸激酶受体，sca1是干细胞抗原1，分子质量为18 ku心磷脂酰肌醇锚定蛋白，Ly6抗原家族的一员，表达在多能造血干细胞(HSCs)上，MHCⅡ可标记心肌结构蛋白肌球蛋白重链。本实验选取以上标记物对培养所得的原代以及传代细胞进行检测、鉴定。实验采用免疫荧光检测到该类原代细胞表面表达目前比较公认的干细胞标记(ckit 、sca1)，经传代培养约一周左右的细胞，干细胞标记(ckit 、sca1)逐渐消失，心肌结构蛋白肌球蛋白重链(MHCⅡ)开始表达。流式细胞仪结果分析可见，原代与传代培养的细胞均基本不表达CD 34、CD 8，排除该类细胞是造血干细胞、成熟内皮细胞的可能性。而早期培养的原代细胞中带有ckit、sca1标记的细胞含量较高，带有MHCⅡ标记的细胞很少，表明原代细胞中干细胞数量较多、较纯，而心肌细胞含量很少。经过传代后的细胞中带有ckit、sca1标记的细胞含量很少，而大部分细胞都带有心肌结构蛋白MHCⅡ标记，同时可出现同步搏动，说明传代后的细胞多为心肌细胞，并且此时的干细胞数量很少。综上所述，实验早期培养得到的原代细胞缺乏血细胞系、造血干细胞、成熟内皮细胞的表面标记CD 34、CD 8，不表达心肌结构基因MHC Ⅱ，而经过传代培养1周之后，开始表达MHCⅡ心肌结构蛋白，并出现心肌样搏动。因此推断该原代细胞很可能是心肌干细胞，其能够经过诱导分化为心肌细胞。实验充分说明，通过改良后的组织块培养法，能够更高效、更快速的培养分离得到心肌干细胞，并分化为可搏动的心肌细胞，表达心肌特异性结构蛋白。成体心肌干细胞的发现为人们选择心肌修复的干细胞类型带来了新希望。

　　【参考文献】

　　[1] NADALGINARD B, KAJSTURA J, Leri A,et al. Myocyte death, growth, and regeneration in cardiac hypertrophy and failure[J].Circ Res,2003, 7;92(2):139150.

　　[2] LESLIE A, LEINWANd. Hope for a Broken Heart[J].Cell,2003,19;114(6):658659.

　　[3] BELTRAMI AP, BARLUCCHI L, TORELLA D, et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration[J]. Cell, 2003,114(6):763776.

　　[4] OH H, BRADFUTE SB, GALLARDO TD, et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003,100(21):1231312318.

　　[5] MATSUURA K, NAGAI T, NISHIGAKI N. Adult cardiac sca1positive cells differentiate into beating cardiomyocytes[J]. J Biol Chem, 2004,279(12):1138411391.

　　[6] MESSINA E, DE ANGELIS L, Frati G, et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart[J]. Circ Res, 2004,95(9):911921.

　　[7] LAUGWITZ KL,MORETTI,A,LAM J, et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages[J]. Nature, 2005,433(7026):647653.

　　[8] KATTMAN SJ,HUBER TL,KELLER GM.Multipotent flk1+ cardiovascular progenitor cells give rise to the cardiomyocyte, endothelial, and vascular smooth muscle lineages[J].Dev Cell,2006,11(5):723732.

　　[9] BARILE L,CHIMENTI I,GAETANI R,et al. Cardiac stem cells: isolation, expansion and experimental use for myocardial regeneration[J].Nat Clin Pract CVardiovasc Med,2007,(Suppl 1):S9S14.

　　[10] 陆东风,吴昊等.新生SD大鼠心肌干细胞的体外分离培养与鉴定[J].南方医科大学学报,2006,11：97100.