青蒿琥酯对人白血病细胞Cyt C依赖性信号途径的影响

　　作者：谢红,姚丽,陈立军,呼文亮　　作者单位：中国人民武装警察部队医学院生物化学教研室，天津 300162

　　【摘要】目的探讨青蒿琥酯作用后人白血病细胞K562的细胞色素(Cyt C)和caspase3表达的变化及其诱导白血病细胞凋亡的分子机制。方法 体外培养K562细胞，用细胞计数法绘制生长曲线;荧光显微镜检测药物作用前后细胞凋亡情况;RTPCR检测caspase3的表达;Western印迹法测定药物作用前后线粒体、细胞浆Cyt C的表达。结果 青蒿琥酯的浓度为1×10-4、1×10-5、1×10-6mol/L时，细胞生长受到显著抑制，并呈剂量依赖性;Hoechst33342/PI双荧光染色可观察到明显的核浓缩、凝集等细胞凋亡表现;RTPCR检测到caspase3的表达;Western印迹法检测药物处理细胞后线粒体Cyt C表达水平下调，细胞浆出现明显Cyt C蛋白条带。结论 青蒿琥酯可诱导白血病K562细胞凋亡，其机制涉及Cyt C依赖性凋亡调节信号通路。

　　【关键词】 青蒿琥酯,K562细胞,凋亡 细胞色素C

　　【Abstract】 Objective To observe the change of cytochrome (Cyt) C and caspase3 expression of the human leukemia cellsK562 effected by artesunate，and to discuss molecule mechanisms of apoptosis. Methods K562 cells were cultured in vitro. The cell growth curve was drawn according to cell counts. Fluorescence microscopy was applied to demonstrate the presence of apoptosis. The expressins of caspase3 were assayed with reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR). The mitochondrion and cytoplasm of K562 cells treated before and after action by artesunate were separated and the expression of Cyt c was measured by Western blot. Results When the concentrations of artesunate were 1×10-4，1×10-5 and 1×10-6 mol/L, the growth of cells was inhibited remarkably in a dosedependent manner. Fluorescence staining showed obvious apoptosis, such as karyopyknosis and agglutination. RTPCR assay showed the expression of caspase3. Artemisinin led to the decrease of mitochondrial Cyt C concentration, presenting obvious Cyt C protein strap in cytoplasm. Conclusions Artesunate can induce apoptosis through Cyt C dependent pathway in leukaemia cells K562.

　　【Key words】 Artesunate; K562 cell lines; Apoptosis; Cytochrome C

　　青蒿琥酯(artesunate，Art)化学名为二氢青蒿素1,2α琥珀酸单酯，分子量384，是具有倍半萜结构的抗疟药青蒿素的衍生物之一。近年来发现青蒿素及其衍生物还具有明显的抗肿瘤作用〔1～4〕。笔者的前期研究表明，青蒿素及其衍生物可抑制肿瘤细胞的生长，且相同浓度下青蒿琥酯的作用最强〔5〕。为深入了解该药的抗肿瘤作用，本文观察了青蒿琥酯诱导癌细胞凋亡的作用，并测定其对线粒体细胞色素C(Cyt C)和caspase3表达的影响，探讨其诱导细胞凋亡的分子机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品及仪器设备 青蒿琥酯(购自成都欧康植化科技有限公司，纯度均≥95%)。Hoechst33342(Sigma公司产品)，PI(Sigma公司产品)，DAB试剂盒(北京中山公司，TBD550)，小鼠单克隆抗Cyt C抗体(SANTA CRUZ);二氧化碳培养箱(Forma)，超纯水器(Millipore)，荧光显微镜(Nikon)，全自动酶标仪(美国，伯乐)，恒温CO2培养箱(美国，FORMA)，DYYⅢ 28A型电泳槽(北京)，半干电转移仪(北京)。

　　1.2 细胞及细胞培养 人白血病细胞(K562)由中国医学科学院血液学研究所提供，培养于含10%小牛血清、100 U/L青霉素、80 U/L链霉素的PRMI1640(pH7.2)培养基中，37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育生长。

　　1.3 生长曲线的制备 配制青蒿琥酯溶液，浓度分别为1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L。取对数生长期的K562细胞制成细胞悬液，调整细胞数为5×104/ml，接种于25 ml培养瓶中，每组设平行瓶，于接种同时给药(对照组加等体积不含胎牛血清的RPMI1640培养基)，于37℃、5%CO2孵育箱中培养。每天随机抽取每组各3瓶细胞，按锥虫蓝拒染法染色，光镜下计数活细胞，取均值。以时间为横坐标，每ml活细胞数为纵坐标作图得生长曲线。

　　1.4 Hoechst33342/PI双荧光染色观察细胞形态 应用电子天平准确称取Hoechst33342、PI各1 mg，分别溶于10 ml DMSO和pH7.2 PBS中使之配成100 μg/ml的储备液，用前等量混合。细胞经药物处理24 h，分别收集细胞，每个标本取200 μl移入Eppendorf管中，加入荧光染料 Hoechst33342至终浓度10 μg/ml，PI 50 μg/ml，37℃下染色15 min，取40 μl细胞悬液迅速滴在载玻片上加盖玻片，在荧光显微镜下观察结果。

　　1.5 RTPCR检测caspase3的表达

　　1.5.1 总RNA提取 用1×10-5mol/L的青蒿琥酯处理细胞，另设对照组，每组细胞设平行瓶，培养24 h后，离心收集细胞，用TRIZOL试剂提取细胞总RNA，操作过程中尽可能避免RNA酶的污染，在低温环境下快速完成。取部分样品稀释，核酸定量仪测定A260/A230与A260/A280的值，鉴定总RNA的纯度。

　　1.5.2 RTPCR 根据Gene Bank提供的caspase3(序号：U26943)与βactin(序号：X63432)的核酸序列，利用计算机软件辅助设计两对引物，上海生工合成。caspase3引物：上游5′GTGGAATTGATGCGTGATG3′，下游5′GGAATCTGTTTCTTTGCATG3′，扩增产物500 bp;βactin引物：上游5′GCACCACACCTTCTACAATG3′，下游5′GTGGTGAAGCTGTAGC3′，扩增产物350 bp。取总RNA各2 μg，按试剂说明书组成20 μl逆转录反应体系，合成cDNA第一链。PCR 50 μl反应体系：cDNA 4 μl，10×PCR缓冲液(含MgCl2)5 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，caspase3和βactin上下游引物各50 pmol，2 U/μl Taq酶1 μl，加ddH2O至50 μl。反应条件：94℃预变性2 min，再30个循环(94℃、45 s，56℃、45 s，72℃、45 s)，72℃充分延伸5 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，紫外透射仪下观察结果。

　　1.6 Western印迹法检测Cyt C表达 Cyt C的提取参照文献〔6〕方法，并略做修改。收集细胞(108/ml)与并于预冷的匀浆缓冲液(250 mmol/L Sucrose，20 mmol/L Hepes/KOH，pH7.5，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L PMSF)400 μl重悬，移入玻璃匀浆器内于冰浴中匀浆5 min，匀浆液于4℃、1 000 g离心10 min，共两次，取上清于4℃、12 000 g离心15 min，收集上清即为不含细胞核和线粒体的胞浆成分，测定样品的蛋白含量，采用Bradford法(均在冰上操作)。取20 μl稀释好的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，转膜后室温下封闭1 h，加入Cyt C单克隆抗体(sc13156)，1∶500稀释，4℃孵育过夜;再与抗小鼠IgGHRP的抗体缓冲液室温孵育1 h，DAB显色观察条带，照相。

　　1.7 统计学处理 测定值以x±s表示，在SPSS11.0软件上完成数据处理。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度青蒿琥酯对白血病K562细胞生长的影响 不同浓度青蒿琥酯处理后K562细胞的生长曲线。用不同浓度(10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L)的药物处理K562细胞时，细胞生长受到显著抑制，并呈剂量依赖性(见图1)。

　　图1 不同浓度青蒿琥酯作用于K562细胞的生长曲线

　　2.2 Hoechst33342/PI双荧光染色观察细胞形态 用Hoechst33342/PI双荧光染色，在荧光显微镜下观察到经青蒿琥酯处理细胞24 h后可见细胞凋亡现象，显示凋亡细胞染色质凝集，细胞核呈固缩块或圆珠状;对照组细胞荧光染色较浅且均匀，细胞核结构正常(图2)。

　　图2 两组K562细胞Hoechst33342/PI染色(×200)

　　2.3 总RNA的提取结果 核酸定量检测，所提取的总RNA的A260/A280为1.9，无异硫氰酸盐类与蛋白质的污染，其浓度约为1 μg/μl，电泳检测RNA完整。

　　2.4 RTPCR检测caspase3基因的表达 1×10-5mol/L青蒿琥酯处理K562细胞24 h后，经逆转录后PCR扩增检测到caspase3基因的表达(见图3)。1×10-5mol/L及1×10-4mol/L青蒿琥酯处理K562细胞24 h后，经逆转录后PCR扩增检测到500 bp处及350 bp处各有一清晰的特异性条带;而对照组细胞只在350 bp处有一清晰的特异性条带。其中500 bp为caspase3基因表达条带，350 bp为βactin的表达条带，说明青蒿琥酯可诱导K562细胞caspase3基因的表达。

　　2.5 Cyt C表达的改变 Western印迹法检测显示，Cyt C在对照组细胞中主要分布于线粒体中，胞浆中未检测到。而用1×10-5mol/L浓度的青蒿琥酯作用K562细胞24 h后，可见胞质中Cyt C的含量明显增多，而线粒体中Cyt C则明显减少(见图4)。

　　3 讨 论

　　肿瘤细胞的迅速生长与扩散转移，是由于细胞死亡过少或增殖过多所致，这种秩序的紊乱源于细胞凋亡能力的减弱或丧失〔7〕，所以诱导肿瘤细胞发生凋亡己成为抗肿瘤的研究热点和有效方法之一。细胞凋亡的发生机制目前认为主要由两条信号通路介导，一条是通过Fas/FasL及TNF/TNFR依次激活caspase8和caspase3的死亡受体通路;另一条是通过线粒体的信号通路，即各种损伤因素通过促进线粒体释放Cyt C等信号分子，然后激活caspase9和caspase3而介导细胞凋亡的发生，此途径是抗癌药物诱导细胞凋亡的一条核心通路〔8〕。caspase3广泛分布于各种类型的细胞中，以无活性的酶原形式存在，激活后裂解成分子量为17 000和12 000的亚单位，较大的亚单位有蛋白裂解活性。凋亡相关基因可以通过改变线粒体膜的通透性，调节胞浆中Cyt C的聚集量来影响caspase3的活性〔9〕，线粒体释放Cyt C是caspase3激活的重要环节。

　　青蒿素类药物是目前最有效且不易产生抗药性的一线抗疟药，其作用广泛，对肿瘤生长的抑制作用亦是近年来研究的新热点之一。有研究表明，青蒿琥酯对鼠艾氏腹水瘤细胞、人淋巴细胞白血病细胞(Molt4)、人宫颈癌细胞(HeLa)和人鼻咽癌细胞(SUNE-1和CNE-1)有细胞毒性作用〔10，11〕，可以抑制其生长。本试验表明，K562细胞经青蒿琥酯处理后，细胞生长受到抑制，并有剂量依赖性，Hoechst33342/PI荧光双染可观察到部分K562细胞出现凋亡小体，胞质Cyt C及caspase3表达阳性，故认为青蒿琥酯可通过线粒体Cyt C依赖性途径引起肿瘤细胞发生凋亡。但青蒿琥酯是否还有其他的途径，尚待进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 Kim SJ，Kim MS，Lee JW，et al.Dihydroartemisinin enhances radiosensitivity of human glioma cells in vitro〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2006;132(2)：12935.

　　2 Paik IH，Xie S，Shapiro TA，et al.Second generation,orally active,antimalarial,artemisininderived trioxane dimers with high stability,efficacy,and anticancer activity〔J〕.J Med Chem，2006;49(9)：27314.

　　3 Yamachika E，Habte T，Oda D.Artemisinin:an alternative treatment for oral squamous cell carcinoma〔J〕.Anticancer Res，2004;24(4)：215360.

　　4 Wang Q，Wu LM，Zhao Y，et al.The anticancer effect of artesunate and its mechanism〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2002;37(6)：4778.

　　5 樊 嵘，谢 红，杨 磊，等.青蒿素及其衍生物抑制K562细胞生长作用比较〔J〕.武警医学院学报，2006;15(3)：199201.

　　6 Yang J，Liu X，Bhalla K，et al.Prevention of apoptosis by Bcl2：release of cytochrome C from mitochondria blocked〔J〕.Science，1997;275(5303)：112932.

　　7 王钦红，谢 毅，范华骅，等.六亚甲基二乙酰胺对急性白血病细胞株HL60和U937分化、凋亡的影响及其机制〔J〕.中华血液学杂志，2004;25(3)：1547.

　　8 Gottlieb RA.Mitochondria:execution central〔J〕.FEBS Lett，2000;482(12)：612.

　　9 Yang XH，Sladek TL，Liu X，et al.Reconstitution of caspase3 sensitizes MCF7 breast cancer cells to doxorubicin and etoposide induced apoptosis〔J〕.Cancer Res，2001;61(1)：34854.

　　10 Beekman AC，Woerdenbag HJ，Van Uden W，et al.Stability of artemisinin in aqueous environments:impaction its cytotoxic action to ehrlich ascites tumour cells〔J〕.J Pharm Pharmacol，1997;49(12)：12548.

　　11 Singh NP，Lai HC.Synergistic cytotoxicity of artemisinin and sodium butyrate on human cancer cells〔J〕.Anticancer Res，2005;25(6B)：432531.