白花丹醌对人急性早幼粒细胞白血病细胞的体外效应

　　作者：赵艳丽,陆道培　　作者单位：北京大学人民医院，北京大学血液病研究所，北京 100044

　　【摘要】根据作者已往的临床经验，中草药白花丹对急性早幼粒细胞白血病(APL)治疗有效，但至今尚无关于白花丹对APL疗效方面的系统研究。本研究的目的是通过NB4细胞体外观察白花丹提取物白花丹醌(plumbagin)对细胞增殖及凋亡的影响。采用MTT比色法检测白花丹醌对NB4细胞增殖抑制作用;用光学显微镜及透射电镜观察细胞形态改变; DNA 凝胶电泳及annexin V / PI双染实验测定检测细胞凋亡;DNA PI 染色法检测细胞亚二倍体峰及细胞周期。结果显示:白花丹醌在2-15 μmol/L浓度范围内能够显著抑制NB4细胞的增殖，且呈剂量依赖性效应关系(P<0.01);在光学显微镜及透射电镜下可见典型的细胞凋亡形态变化;白花丹醌诱导细胞出现DNA 梯形条带，annexin V+/PI-凋亡细胞及亚二倍体峰，细胞周期阻滞于G2/M期，凋亡细胞比例与白花丹醌呈剂量依赖性效应关系(P< 0.05)。结论：本研究首次证实白花丹醌能够抑制APL细胞系NB4的增殖、诱导细胞凋亡及阻滞细胞周期进程。

　　【关键词】 白花丹醌

　　Abstract According to previous clinical experiences of the authors，plumbago zeylanica was effective against acute promyelocytic leukemia (APL).However，its effectiveness has never been proven experimentally or unequivocally clinically.This study was aimed to investigate the effects of plumbagin on the proliferation，cell cycle and apoptosis of APL cell line NB4 Cells.Cell inhibitory rates were detected by MTT colorimetric assay;morphologic changes were observed under light microscope and transmission electron microscope; apoptosis-inducing effects were determined by DNA gel electrophoresis，annexin V/ PI double-stained and PI single-stained flow cytometry.The results demonstrated that 2-15 μmol/L plumbagin inhibited the proliferation of NB4 cells in a dose-dependent manner.The morphologic changes of cell apoptosis，such as chromsome condensation and apoptotic body formation，were observed by light microscope and transmission electron microscope.Cell cycle analysis showed that NB4 cells were blocked in G2/M phase of cell cycle.And plumbagin induced annexin V+/PI-cell increase and DNA fragmentation.There was a correlation between cell apoptosis rates and the concentrations of plumbagin in dose-dependent manner (P<0.05).It is concluded that for the first time the present study shows that plumbagin can inhibit cell proliferation，block cell cycle and induce apoptosis of APL cell line NB4 cells.

　　Key words plumbagin; acute promyelocytic leukemia; NB4 cell; apoptosis

　　白花丹是一种生长在我国四川、福建、台湾、广西、广东等地区的常见植物，容易采获。白花丹具有祛风散瘀、解毒杀虫、消肿止痛等作用，用于血瘀经闭、跌打损伤、痈肿疮毒等。白花丹醌(plumbagin)是白花丹的主要活性成分，具有广泛的药理活性，包括抗菌消炎、抗生殖、抗凝等作用[1-3]。研究表明，白花丹醌能够抑制P388淋巴细胞白血病、宫颈癌、肝癌等多种肿瘤细胞，是一种很有潜力的抗肿瘤药物[3-6]。根据作者已往的临床经验，中草药白花丹对人急性早幼粒细胞白血病(APL)治疗有效。但迄今为止尚无关于白花丹提取物白花丹醌对APL疗效的研究报道。本研究旨在以NB4细胞为体外模型，初步探讨白花丹提取物白花丹醌对APL细胞的增殖、细胞周期及凋亡的影响。

　　材料和方法

　　主要药物及试剂

　　白花丹醌(plumbagin，Lot：023K0760)为美国Sigma公司产品，溶解于二甲亚砜(DMSO) 中，配成 0.1 mol/L储备溶液，置于-4℃保存，使用时应用RPMI 1640 培养液稀释至工作浓度(工作液中DMSO终浓度均小于0.1%，预实验证实对NB4细胞无影响)。胎牛血清为TBD产品，annexin V/ PI 试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。

　　细胞系及细胞培养

　　人APL细胞系NB4细胞为本所长期保存，培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素的RPMI 1640 培养液中，置37℃、 5 % CO2 、饱和湿度的培养箱中培养，3-4天传代1次，取对数生长期细胞进行实验，台盼蓝染色拒染率均在95%以上。

　　NB4细胞增殖的检测

　　取对数生长期细胞进行实验，以5×104/ ml浓度将NB4细胞接种于96孔培养板(Costar)，每孔180 μl，置37℃、5 % CO2 培养箱中培养24小时后进行实验。设不同浓度组、细胞对照组和空白对照组，每组设4-6个平行孔，继续培养24小时或48小时，实验终止前加入MTT(5 mg/ml)工作液，37℃孵育4小时，离心弃上清。加入100 μl 10% SDS-0.01 NHCl，避光过夜，酶标仪570 nm测吸光度A值。实验重复3次，计算细胞生长抑制率(%)，其公式为：

　　生长抑制率(%)= (1-实验组A值/

　　对照组A值)×100 %。

　　NB4细胞形态观察

　　白花丹醌作用NB4细胞24小时后于倒置显微镜下(日本Olympus IMT-2)观察培养瓶内细胞形态。另外，收获 1×107个细胞，PBS 洗2次，2.5%戊二醛固定液4℃下固定2小时以上，1%锇酸4℃下固定2小时，梯度丙酮脱水，浸透，包埋，超薄切片后，铀及铅双重染色，透射电镜(日本电子100CX-Ⅱ)下观察细胞超微结构变化并摄像。

　　凋亡细胞的DNA片段凝胶电泳

　　收获各组培养细胞，用常规盐析法提取基因组DNA，2%琼脂糖电泳，紫外线光下观察并记录结果。细胞凋亡的annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术(FCM)检测

　　按照说明书操作，离心收集106个细胞，用PBS洗2遍，将细胞重悬于200 μl bingding buffer中，加入annexin-FITC中混匀，避光4℃反应30分钟，加入PI 5 μl，避光4℃反应5分钟，加入300 μl bingding buffer，立即上流式细胞仪(FACScan 型，美国Becton Dickinson公司)检测。实验重复4次取均值。

　　细胞DNA含量的DNA PI染色FCM测定

　　将收集的NB4细胞在预冷的75%乙醇中固定，-20℃过夜，PBS缓冲液洗去固定液，RNase A 消化，PI染色，FCM检测，用随机所附的cell modifit 软件分析细胞周期。低于G1期的细胞(亚二倍体)为凋亡细胞，其占细胞总数的比例为凋亡细胞率。

　　统计分析

　　数据以均数±标准差(x±SD) 表示，采用SPSS 10.0 软件包处理，P<0.05为有显著性差异。

　　结 果

　　白花丹醌对NB4细胞的增殖抑制作用

　　MTT检测显示，白花丹醌在2-15 μmol/L浓度范围内对NB4细胞均有增殖抑制作用，随着白花丹醌浓度的增加，NB4细胞活力下降，与对照组相比，差异具有显著性(P< 0.01)(表1)。白花丹醌作用24小时的IC50约为9　μmol/L，48小时的IC50约为5　μmol/L。Table 1.Effects of plumbagin on NB4 cell proliferation (略)

　　白花丹醌诱导NB4细胞凋亡

　　倒置显微镜观察 对照组细胞则明显聚集成簇，部分贴壁。白花丹醌作用后的NB4细胞数量减少，细胞大小不均，折光性减弱，细胞核固缩，细胞变分散。

　　透射电镜(TEM)观察

　　部分细胞细胞器生物膜皱褶起泡，胞浆中出现空泡，细胞体积缩小，细胞器致密化，核染色质浓缩边集形成新月体，细胞膜及核膜相对完整;还有部分细胞核碎裂及凋亡小体形成(图1)。

　　凋亡细胞的DNA琼脂糖电泳

　　NB4细胞在浓度为5、10、15　μmol/L的白花丹醌作用24小时后，在DNA琼脂糖电泳显示清晰的DNA 梯形条带(图2)。

　　Annexin Ⅴ/ PI染色检测结果

　　白花丹醌作用NB4细胞后annexin V+PI+及annexin V+PI-细胞均增多(图3)，说明白花丹醌细胞凋亡的作用，随着白花丹醌浓度的增加，NB4 细胞早期凋亡率递增(P< 0.05)(表2)。Table 2.Effect of plumbagin on apoptosis rates (%) of NB4 cells determined by annexin V/PI staining (略)

　　白花丹醌诱导NB4细胞G2/M期阻滞

　　白花丹醌作用24小时后，NB4 细胞出现亚二倍体细胞，且凋亡细胞比例与白花丹醌浓度呈剂量依赖关系(P< 0.05);同时白花丹醌作用后G2/M期细胞增多，提示白花丹醌能够影响细胞周期进程，使细胞阻滞于G2/M期(表3，图4)。Table 3.Effect of plumbagin on the distributions of cell cycle and sub-G1 phase (略)

　　讨论

　　白花丹醌是白花丹科植物白花丹Plumbago zeylanica Linn全草及干燥根的主要有效成分[1-3]。白花丹醌是一种小分子萘醌化合物，为棕黄色结晶，熔点为76-78℃，溶于乙醇、氯仿，微溶于沸水。其分子式为C11H8O3，相对分子量为188.18，化学结构式是5-羟基-2-甲基-1，4萘醌(5-hydroxy-2-methyl-1，4-naphthoquinone)。研究发现，白花丹醌具有抗肿瘤、抗炎、抗细菌、抗真菌等多种作用[1，2，5]。白花丹醌在体外对多种肿瘤细胞系有增殖抑制作用，体内试验也有抗肿瘤作用[4-6]。

　　恶性肿瘤的发生和细胞增殖与凋亡平衡失调有关[7]，细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用，可以遏制肿瘤迅速生长，人们在肿瘤治疗的长期实践中，逐渐认识到可以通过诱导肿瘤细胞凋亡达到治疗肿瘤的目的。本研究通过形态学检测、膜联蛋白染色、DNA凝胶电泳及亚二倍体检测证实，白花丹醌可诱导NB4细胞凋亡，且凋亡细胞比例与白花丹醌浓度呈依赖关系。Srinivas[6]等研究结果表明，白花丹醌可诱导宫颈癌细胞凋亡，其作用机制与白花丹醌增加通过胞内的活性氧物质(ROS)含量，激活caspase-3、-9，促进凋亡诱导因子(AIF)释放有关。白花丹醌诱导APL细胞凋亡的作用机制尚待进一步研究证实。 细胞周期是维持细胞正常分裂增殖的重要环节，如果细胞周期的某个环节受阻，细胞生长就会受到抑制。我们的研究发现白花丹醌作用后的NB4细胞后G2/M期细胞增多，这提示白花丹醌具有调控G2/M期调控点的能力。Jaiswal等[8]在小鼠胚胎纤维母细胞的研究中发现，白花丹醌通过诱导周期蛋白依赖蛋白激酶抑制剂(CDKI)——p21的产生，调节细胞周期阻滞于 S-G2/M 期。

　　本研究结果显示，白花丹醌体外可抑制细胞增殖，调控细胞周期进程及诱导细胞凋亡，有望成为APL新的辅助治疗方法。本实验仅探讨了白花丹提取物白花丹醌在体外对人APL细胞系NB4细胞的影响，其在体内对细胞的影响尚有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 郭晓庄.有毒中草药大辞典.天津：天津科技翻译出版公司.1992： 177-179

　　2 《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编.北京: 人民卫生出版社.1975： 288

　　3 Lin LC，Yang LL，Chou CJ.Cytotoxic naphthoquinones and plumbagic acid glucosides from Plumbago zeylanica.Phytochemistry，2003; 62: 619-622

　　4 赵铁建，钟振国，方卓等.白花丹水煎液对小鼠四氯化碳肝损害的影响.广西中医学院学报，2004; 7: 43-45

　　5 Krishnaswamy M，Purushothaman KK.Plumbagin: a study of its anticancer，antibacterial and antifungal properties.Indian J Exp Biol，1980; 18: 876-877

　　6 Srinivas P，Gopinath G，Banerji A，et al. Plumbagin induces reactive oxygen species，which mediate apoptosis in human cervical cancer cells.Mol Carcinog，2004; 40: 201-211

　　7 Devi PU，Rao BS，Solomon FE.Effect of plumbagin on the radiation induced cytogenetic and cell cycle changes in mouse Ehrlich ascites carcinoma in vivo.Indian J Exp Biol，1998; 36: 891-895

　　8 Jaiswal AS，Bloom LB，Narayan S.Long-patch base excision repair of apurrinic/apyrimidinic site DNA is decreased in mouse embryonic fibroblast cell lines treated with plumbagin: involvement of cyclin-dependent kinase inhibitor p21Waf-1/Cip-1.Oncogene，2002; 21: 5912-5922