51例慢性淋巴细胞白血病的免疫表型及细胞遗传学特征研究

　　作者：马勤芬,周惠芬,朱明清,刘丹丹,陈子兴　　作者单位：苏州大学附属第一医院，江苏省血液研究所, 苏州 215006

　　【摘要】本研究探讨慢性淋巴细胞白血病 (CLL)的免疫表型及细胞遗传学特征，为其诊断及治疗提供依据。采用一组系列相关单克隆抗体和三色流式细胞术对51例CLL患者进行免疫表型分析，并应用R显带技术对这51例患者的细胞遗传学异常进行了研究。结果表明：51例CLL患者中，CD19和CD23阳性率为96.1%，其后依次为CD5(94.1%)、CD20(82.4%)和CD22(78.4%)，CD38阳性率为23.5%。CD5和CD19共阳性者46例(90.2%)。51例患者的染色体异常检出率为35.3%(18/51)，共检出7种主要异常核型，其中+12有3例，13q-有2例，其它主要异常有+14、6q-、t(11;14)、t(14;18)和t(2;7)等。各抗原表达与染色体异常无显著性差异(p>0.05)。结论：典型CLL免疫表型为CD5、CD19和CD23阳性;常规细胞遗传学(CC)检测CLL染色体异常阳性率偏低;免疫表型结合细胞遗传学异常对CLL诊断及预后有重要价值。

　　【关键词】 慢性淋巴细胞白血病

　　Abstract The study was aimed to investigate the immunophenotypic and cytogenetic features of chronic lymphocytic leukemia (CLL) in order to provide an evidence for diagnosis and therapy. Immunophenotypic analysis was performed by using a panel of monoclonal antibodies and threecolor immunofluorescence staining methods of flow cytometry in 51 patients with CLL, and the cytogenetic features were analyzed by Rbanding technique. The results indicated that among 51 CLL cases, the positive rate of CD19 and CD23 was 96.1%, followed by CD15 (94.1%), CD20 (82.4%) and CD22 (78.4%). The positive rate of CD38 was 23.5%. Fortysix patients expressed both CD5 and CD19. Seven main clonal chromosomal abnormalities were detected by conventional cytogenetics (CC) in eighteen cases (35.3%), with three cases of +12, two cases of 13q-, other chromosomal abnormalities included +14, 6q-, t(11;14), t(14;18) and t(2;7). Expression of the antigens had no relationship with chromosomal abnormalities. It is concluded that typical CLL express CD5, CD19 and CD23,and the positive rate detected by CC in CLL is low. Immunophenotyping in combination with cytogenetic technique plays an important role in the diagnosis and prognosis of CLL.

　　Key words chronic lymphocytic leukemia; immunophenotype; flow cytometry; cytogenetics

　　J Exp Hematol 2007; 15(4):696-699

　　慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种低度恶性的小淋巴细胞异质性疾病，以外周血及骨髓中成熟的淋巴细胞增多为主要临床特点。CLL有两种类型，BCLL占95%，TCLL仅占5%[1]。CLL 的免疫表型及细胞遗传学特征研究对CLL鉴别诊断及预后判定有重要意义。现将我院自2001年以来检测的51例CLL患者的免疫表型及细胞遗传学特征分析如下。

　　材料和方法

　　病例资料

　　苏州大学附属第一医院2001年7月-2005年4月初诊CLL患者51例，其中男性35例，女性16例，年龄44-84岁，中位年龄63岁，其中>60岁者38例。CLL诊断与分型参照《血液病诊断及疗效标准》[2]。CLL评分依据2001年WHO计分系统[3](表1)，典型CLL积分4-5分。

　　试剂与仪器

　　单克隆抗体包括CD5、CD10、 CD19、 CD20、 CD22、 CD23、CD38和FMC7，所有单克隆抗体及相应的阴性对照均为法国Immunotech公司产品。流式细胞仪为BeckmanCoulter公司的Epics XL 型(USA)，采用Expo32ADC分析软件。

　　新鲜抽取(6小时内)的骨髓或外周血置于肝素抗凝管内，调整细胞数至(0.5-1.0)×106/ml，取100 μl经直接免疫荧光标记法标记，避光保存15分钟之后加溶血剂溶解红细胞。流式细胞术分析时均采用FSvsSS一次设门取淋巴细胞群，再行二次设门取CD5+CD19+双阳性细胞后分析其余抗原表达，CD5-患者二次设门采用CD23+CD19+设门后分析其余抗原表达。结果判断以白血病细胞表面抗原表达≥20 %幼稚细胞群为阳性。

　　细胞遗传学分析

　　治疗前抽取患者骨髓或外周血，肝素抗凝，调整细胞数至(1-2)×106/ml，在培养液中分别加入刺激淋巴细胞生长的有丝分裂刺激剂PHA/IL2培养72小时，按常规制备染色体标本, 然后采用R 显带技术进行核型分析[4]。每例患者至少分析20个中期细胞，染色体核型描述按《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN 2005)》[5]。

　　统计学分析

　　采用χ2检验。

　　结 果

　　各抗原在CLL中的表达情况

　　本组51例CLL患者中，CD19和CD23阳性率均为96.1%，其次为CD5(94.1%)、CD20(82.4%)和CD22(78.4%)，CD38阳性率23.5%。CD5和CD19共阳性者46例。分别有2例和5例患者表达CD10和FMC7(表2)。

　　CLL的核型异常分析

　　在51例CLL患者中，异常染色体检出率为35.3% (18/51)，16例女性患者中8例 (50.0%)有核型异常，35例男性患者中10例 (28.6%)有核型异常，男女两组核型异常频率的差异无显著性 (p>0.05)。在本组病例中共检出7种主要异常核型，其中+12有3例(图1)，13q-有2例，其他主要异常有+14、6q-、t(11;14)(图2)、t(14;18)和t(2;7)等。

　　18例伴有染色体异常的患者中CD5阳性16例，CD10阳性1例，CD19阳性17例，CD20阳性15例，CD22阳性11例，CD23阳性15例，CD38阳性3例，FMC7阳性2例，各抗原表达与染色体异常无显著性差异(p>0.05)。

　　讨 论

　　流式细胞术(FCM)白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体(McAb)作分子探针，多参数分析白血病细胞的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。由于能够快速，多参数，客观地测定细胞抗原表达，近年FCM已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要检测手段。CLL是一种低度恶性的淋巴细胞恶性增殖性疾病，其特点为外周血大量单克隆性的淋巴细胞积累，并浸润肝、脾及淋巴结等器官。CLL好发于老年男性，平均发病年龄为60-70岁，罕见小于30岁的病例。本组51例患者中位发病年龄为63岁，其中>60岁者38例，也说明了CLL好发于老年患者。

　　在CLL患者中，淋巴细胞具有特征性的免疫表型。BCLL病例起源于B淋巴细胞恶性转化和克隆，其主要的表型特点是CD5阳性的B细胞，即CD5+CD19+，同时伴CD23+，CD20+，弱表达CD22，不表达FMC7[3，6]。本研究中有46例(90.2%)为CD5和CD19共阳性;另有3例患者(5.8%)不表达CD5，2例患者(3.9%)不表达CD23，但此5例患者无1例出现CD5和CD23双阴性，结合细胞形态学、遗传学及临床表现进一步诊断为不典型BCLL。因此联合测定CD19和CD5对CLL诊断有重要价值。在对BCLL免疫表型分析时，应先以FSvsSS设门取淋巴细胞群后，再行二次设门取CD5+CD19+双阳性细胞后分析其余抗原表达，对于少数CD5- BCLL患者应设门取CD23+CD19+双阳性细胞后再进一步分析其余抗原表达，以确保所测得的抗原表达为肿瘤细胞。尽管有文献报道[6]CLL中CD22的表达多为阴性，本研究中有78.4%患者表达CD22，可能与抗体荧光素的选择相关。

　　目前大部分研究认为，CD38表达与CLL预后呈负相关。Poeta等[7]探讨了168例BCLL患者CD38表达的临床意义，发现CD38+患者无进展生存期(PFS)较CD38-者明显缩短(5年PFS分别为37% vs 75%)，对化疗药物反应差，病情进展迅速，完全缓解(CR)率低。Ibrahim等[8]的研究显示，仅43%的BCLL患者CD38阳性表达(阳性细胞率≥20%)，CD38阳性患者与CD38 阴性患者相比临床分期偏后期，生存期也明显缩短。Gentile等[9]对242例患者进行研究发现CD38+与CD38-相比，男性多于女性，血红蛋白和血小板计数显著减少，淋巴细胞计数明显增加;而在年龄、乳酸脱氢酶水平、形态学及免疫学特征方面无明显差异。CD38+还是疾病侵袭性的一个重要标志，无论患者的临床分期如何，即使处于Rai分期的0期，CD38+患者亦常具有明显的侵袭性。以上这些资料显示，CD38的表达是CLL的重要的独立的预后因素。本研究51例CLL患者中有12例患者表达CD38，其中18例伴有染色体异常的患者中3例阳性，其染色体异常均为复杂染色体异常，提示可能与预后不良有关，但是由于病例数较少，有待进一步积累病例进行研究。

　　CLL有多种不同的核型异常，应用有丝分裂原刺激剂后常规细胞遗传(CC)技术可在40%-50%的CLL中检出染色体异常。其中+12约见于19%的CLL患者，13q-和14q+分别见于10%和8%的CLL患者。11q-、6q-和17p-分别见于7%、6%和4%的CLL患者[10]，而应用荧光原位杂交(FISH)技术可将染色体异常的检出率提高到82%[11]。本研究染色体异常检出率为35.3%，略低于文献报道。共检出7种主要异常核型，其中+12有3例，13q-有2例，其他主要异常有+14、6q-、t(11;14)、t(14;18)和t(2;7)等。

　　目前大部分研究表明，染色体异常是判断CLL预后的重要因素。Dewald等[11]认为，13q-常于Binet A期时出现，预后较好，或与正常核型患者相似;而伴有+12、11q-或17p-患者的预后均较差，复杂异常和不良预后显著相关。

　　+12见于15%-45%的CLL患者，在外周血、骨髓、淋巴结中均能检出。一对12号染色体中的一条染色体复制，另一条保留，存在于同一细胞，形成三体。但在BCLL中很少发现部分12染色体三体，因此难以找到12染色体上与发病机理有关的基因。在不典型CLL中，+12的发生率显著高于典型CLL[12]，前者占35.8%-65%，而后者仅占3.5%-9.7%，常在疾病的进展期或晚期出现，约50%以上的+12患者伴有不典型的淋巴细胞形态，SmIg 和FMC7强表达，Binet分期提前，疾病进展，对嘌呤类似物的反应较差，生存期短，因而需要积极的治疗。以上研究提示+12在CLL的发病机制中起着重要作用，检测+12对诊断、预后都有相当特异性和重要意义。

　　14q+是CLL最常见的染色体异常之一，约8%的CLL存在14q畸变[1]。14q+常涉及14q32，是14号染色体和另一条染色体易位所致，伙伴染色体可以是1、2、4、6、8、10-19、22和Y，但以t(11;14)和t(14;19)多见。前者导致位于14q32的免疫球蛋白重链(IgH)与位于11q13的细胞周期蛋白D1(cyclin D1)并置，激活bcl1基因，淋巴细胞数增高伴幼淋细胞增高，抑细胞治疗反应差;后者是一种较少的但常常发生在B细胞恶性肿瘤的易位，导致IgH与位于19q13的bcl3并置，从而激活bcl3基因，年龄常常<40岁，淋巴细胞形态不典型，疾病进展迅速，预后差。

　　总之，联合应用免疫分型和细胞遗传学对CLL的诊断、治疗及预后有重要的价值。但是应用常规细胞遗传学方法对CLL染色体异常检出率较低，因此有条件者可应用FISH技术来提高其阳性检出率。

　　【参考文献】

　　1Reed JC. Molecular Biology of chronic lymphocytic leukemia. Semin Oncol,1998; 25:11-18

　　2张之南, 沈悌. 血液病诊断及疗效标准. 第2版. 北京：科学出版社. 1998: 228-237

　　3MullerHermelink HK, Montserrat E, Catovsky D, et al. Chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma in WHO classification of tumours: Pathology and genetics of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. In: Jaffe E, Harris NL, Stein H, et al eds. Lyons: LARC. 2001:127-130

　　4李倩、薛永权、姜海燕等. PHA、IL2和PHA/IL2在慢性淋巴细胞白血病染色体系统中的应用. 江苏医药杂志，2004; 30：296-297

　　5Lisa GS, NielsT. An international system for human cytogenetic nomenclature. Basel: ISCN. 2005: 39-46

　　6Damle RN, Ghiotto F, Valetto A, et al. Bcell chronic lymphocytic leukemia cells express a surface membrane phenotype of activated, antigen experienced B lymphocytes. Blood, 2002; 99: 4087-4093

　　7DelPoeta G, Maurillo L, Venditti A, et al. Clinical significance of CD38 expression in chronic lymphocytic leukaemia. Blood, 2001; 98: 2633-2639

　　8Ibrahim S, Keating M, Do KA, et al. CD38 expression as an important prognostic factor in Bcell chronic lymphocytic leukemia. Blood, 2001; 98:181-186

　　9Gentile M, Mauro FR, Calabrese E, et al. The prognostic value of CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia patients studied prospectively at diagnosis: a single institute experience. Br J Haematol, 2005; 130: 549-557

　　10薛永权. 白血病细胞遗传学及图谱. 天津: 天津科技出版社, 2003: 51-52

　　11Dewald GW, Brockman SR, Paternoster SF, et al. Chromosome anomalies detected by interphase fluorescence in situ hybridization: correlation with significant biological features of Bcell chronic lymphocytic leukemia. Br J Haematol, 2003; 121: 287-295

　　12Mayr C, Speicher MR, Kofler DM, et al. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood, 2006; 107: 742-751