新型人趋化素样因子超家族8对人白血病细胞增殖和表皮生长因子受体表达的影响

　　作者：陈绍倩,杜英,黄玉敏,王鑫,顾巧丽　　作者单位：郑州大学第一附属医院血液科,郑州 450055; 郑州大学基础医学院，　1免疫学教研室; 2病理生理学教研室，郑州 450042

　　【摘要】本研究探讨新型趋化因子CKLFSF8对人白血病HL60细胞的增殖和表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响，应用RTPCR方法检测CKLFSF8基因在HL60细胞中的表达;利用脂质体将CKLFSF8基因转染到HL60细胞，在倒置显微镜下观察细胞生长;MTT法检测细胞的增殖程度;免疫细胞化学法检测CKLFSF8基因转染前后HL60细胞EGFR的表达。结果表明： 在细胞生长过程中可检测到CKLFSF8表达;CKLFSF8基因转染前后HL60细胞的增殖受到了明显的抑制，与空白对照组和空质粒组相比有显著性差异(P﹤0.05);对比转染前后细胞EGFR表达的阳性率具有显著性差异(P﹤0.01)。结论： CKLFSF8基因转染对白血病细胞HL60的增殖和EGFR的表达有明显抑制作用。

　　【关键词】 CKLFSF8, HL60细胞, 细胞增殖; EGFR

　　Abstract This study was aimed to investigate the effect of chemokinelike factor superfamily 8 (CKLFSF8) on proliferation and expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) of HL60 cells. Expression of CKLFSF8 mRNA on HL60 cell line was assayed by RTPCR; the target gene was transfected into the cells by lipid vector, cell proliferation was determined by MTT assay, while expression of EGFR in HL60 was determined by immunocytochemical technique. The results indicated that expression of CKLFSF8 existed in HL60 cells. After transfection, cell proliferation was inhibited (P﹤0.05) and the expression of EGFR in HL60 cells was also discovered to be inhibited (P﹤0.05). It is concluded that the proliferation and expression of EGFR in HL60 cells can be inhibited by transfection of CKLFSF8. The novel chemokine may provide a new approach in the treatment of leukemia.

　　Key words CKLFSF8; HL60 cell; cell proliferation; EGFR

　　J Exp Hematol 2007; 15(3):458-461

　　趋化因子(chemokine)是一组具有趋化活性的小分子蛋白质,在炎症、肿瘤、自身免疫性疾病、变态反应及AIDS的演化等过程中发挥重要作用[1]。趋化素样因子超家族成员8 (chemokinelike factor superfamily， CKLFSF8)是新近发现的新型人类趋化因子。研究发现，大多数细胞内都有该因子的表达，在肝脏、肺脏和胰腺细胞内高表达;CKLFSF8 在某些肿瘤组织和肿瘤细胞中也有表达[2]，但有关CKLFSF8对肿瘤细胞表皮生长因子影响的研究报道尚少。为了探讨这种新的趋化因子在白血病的发生发展中的作用，我们选择白血病细胞株HL60为研究对象，观察新型细胞因子CKLFSF8对HL60的增殖和表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor， EGFR)表达的影响。

　　材料和方法

　　菌株和质粒

　　E.coli DH5α购自Gibco公司。带有目的基因片段CKLFSF8的质粒pCDNA3.1和pEGFP由北京大学人类疾病基因研究中心马大龙教授惠赠。人白血病限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ为TakaRa产品。质粒提取试剂盒为Vegen产品。RPMI 1640及TRIZOL RNA提取试剂为Gibco产品。RTPCR试剂为上海生物工程技术有限公司产品。小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品。转染试剂 LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品。山羊抗人EGFR抗体为Santa Cruz公司产品。免疫组织化学试剂盒为北京中杉生物技术有限公司产品。

　　HL60细胞的培养和RNA的提取

　　将HL60细胞接种于含100 ml/L小牛血清的RPMI 1640 培养液，置37℃ 5% CO2培养箱中常规培养。取生长旺盛的HL60细胞，按TRIZOL试剂盒说明书提取肿瘤细胞总RNA。

　　HL60细胞CKLFSF8的检测

　　采用RTPCR法，将HL60细胞总RNA进行反转录。根据CKLFSF8 mRNA序列设计引物，上游为 3'GCCTTCATGAGTCAAGGTCGT5'，下游为5'AGA GAGGTAGAAGACGAAGGC3'。PCR反应条件94℃ 7分钟,94℃ 30秒,59℃ 30秒,72℃ 40秒,72℃ 7分钟，共进行35个循环。 βactin做内对照。10 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察扩增产物片段。

　　质粒扩增和鉴定

　　制备感受态细胞，用质粒pCDNA3.1-CKLFSF8进行转化，涂在含有氨苄青霉素的培养基上，37℃培养12小时，挑取单个菌落，37℃震摇培养3小时，按质粒提取试剂盒方法提取质粒。将质粒分别进行EcoRⅠ单酶切和EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切。琼脂糖电泳鉴定获得的CKLFSF8基因片段。

　　CKLFSF8基因转染HL60细胞

　　按试剂盒使用说明书进行转染。取1×106个处于对数生长期的HL60细胞，用无血清培养基洗2次，用500 μl无血清培养基接种于6孔培养板，将2 μg带有目的基因片段CKLFSF8的质粒pCDNA3.1与10 μl脂质体混合后缓慢均匀加到细胞表面，孵育5小时后更换2倍血清浓度的完全培养液，培养24小时。更换完全培养液，继续培养48小时收获细胞进行检测。首先以带绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-CKLFSF8转染HL60细胞来检测转染率。用荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白表达的情况，计数10个视野的细胞，取平均值作为转染率。然后分别设未转染质粒的对照组、pCDNA3.1质粒对照组和pCDNA3.1-CKLFSF8质粒转染组。

　　HL60细胞增殖的检测

　　将200 μl 105个转染细胞和对照组细胞分别加入96孔细胞培养板，每组3个复孔，37℃ 5% CO2 培养48小时,每孔加入MTT(5 mg/mL)10 μl ,继续培养4小时。小心吸出培养上清，每孔加入100 μl二甲基亚砜，震荡溶解颗粒,用酶标检测仪测定A570值。

　　CKLFSF8基因转染HL60细胞前后EGFR表达的检测

　　采用免疫细胞化学方法检测。HL60细胞做细胞滴片，用800 ml/L丙酮固定10分钟，pH 7.4 PBS冲洗，依次在标本片上滴加1∶500稀释的山羊抗人EGFR抗体，用PBS冲洗后，滴加辣根过氧化物酶标记的小鼠抗山羊二抗，DAB显色，光学显微镜下观察，阳性细胞是被染成棕色的细胞，各观察10个视野，计数200个细胞，计算EGFR阳性表达率。

　　阳性率=(阳性细胞数/细胞总数) ×100%

　　统计学处理

　　实验所得数据用SPSS 11.5 软件进行t 检验,用均数±标准差( ±SD ) 表示。

　　结 果

　　CKLFSF8基因在HL60细胞中的表达

　　白血病细胞株HL60总RNA RTPCR结果显示，在100-250 bp之间出现单一电泳带(图1)。根据所设计引物和GeneBank中 CKLFSF8 mRNA的序列，扩增产物片段应为187 bp，与电泳带符合。这说明CKLFSF8基因在这种细胞中有表达。

　　Figure 1. mRNA expression of CKLFSF8 in HL60. Lane 1: β-actin. Lane 2: CKLFSF8 fragment. M: marker DL2000.

　　CKLFSF8pCDNA3.1质粒的酶切鉴定

　　质粒CKLFSF8pCDNA3.1经EcoRI单酶切得到该质粒的全长DNA片段，为6 020 bp。经EcoRI和BamHI双酶切得到长度分别为5 500 bp和520 bp两个DNA片段，其中520 bp片段为CKLFSF8基因。

　　Figure 2. Restrictive analysis of the recombinant plasmid CKLFSF8pCDNA3.1. Lane 1: CKLFSF8pCDNA3.1/EcoRI+BamHI. Lane 2: CKLFSF8pCDNA3.1/EcoRI. M: DNA marker.

　　CKLFSF8基因转染对HL60细胞增殖的影响

　　与空质粒对照组和空白对照组相比CKLFSF8质粒组 A570值显著降低(P﹤0.01)，而空质粒组和空白组无显著性差异(P﹥0.05)。这说明CKLFSF8对白血病细胞HL60有明显抑制作用(附表)。

　　Table . Effect of CKLFSF8 on proliferation of HL60 cells

　　GroupHL60CKLFSF8 pCDNA3.10.65±0.12**pCDNA3.10.98±0.06*Control group1.02±0.05*P﹥0.05 compared with control group; **P﹤0.01 compared with control group and pCDNA3.1.

　　CKLFSF8基因转染对HL60 EGFR表达的影响

　　荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白的表达情况，并且经过计算得出脂质体介导的HL60细胞的转染率是60.5%。CKLFSF8质粒转染HL60细胞前后EGFR表达的阳性率比较，转染前阳性率为(94.0±2.23)%，转染后阳性率为(76.2±4.45)%,差异具有统计学意义(P﹤0.01)，说明CKLFSF8对HL60细胞的EGFR表达有抑制作用。

　　讨 论

　　趋化因子是一组结构相似的小分子蛋白质，在蛋白质水平上含有4个保守的半胱氨酸，根据前2个半胱氨酸的相对位置不同，可分为CXC(α)、CC(β)、C(δ)和CX3C(γ)4个亚家族，C代表半胱氨酸，X代表任一氨基酸[3]。北京大学人类疾病基因研究中心从人单核细胞的前体细胞株U937细胞中分离出一种新的细胞因子命名为趋化素样因子1(chemokinelike factor 1， CKLF1)[4]，因其氨基酸序列中有3个半胱氨酸，最后2个连续排列，呈CC家族趋化因子的特征性结构，因此将其归为CC家族趋化因子[5]。随后运用生物信息学的方法,又发现与CKLF1有同源性的其它8个基因,分别命名为趋化素样因子超家族成员1-8(chemokinelike factor superfamily 1-8， CKLFSF18)[6]。其中，CKLFSF8基因位于第3号染色体(3p23)，其cDNA全长1185 bp，其中第295816位核苷酸编码173个氨基酸组成的CKLFSF8蛋白分子，该蛋白属CKLF1 超家族成员，包括4个跨膜区和1个MARVEL(MALrelated proteins for vesicle trafficking and membrane link domain)结构域，该结构域与TM4SF(transmembrane 4 superfamily)结构相似，且CKLFSF8与TM4SF有39.5%氨基酸相同[3]。CKLFSF8分子有2个变异体，分别由173和115个氨基酸残基组成。本实验就其中1个变异体即由173个氨基酸残基组成的趋化因子进行了研究。

　　在本实验中，利用含CKLFSF8的pCDNA3.1质粒转染HL60细胞，对转染前后细胞株中该因子的表达情况进行观察。结果显示，HL60细胞能表达CKLFSF8，转染CKLFSF8后细胞内CKLFSF8过表达，细胞的增殖明显被抑制，与对照组相比有显著性差异。

　　表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor， EGFR)是一种位于细胞膜上的酪氨酸激酶受体，其编码基因又称erbB1。EGFR与其配体结合后，通过自身磷酸化介导细胞内一系列的生长信号，促进细胞增殖。同时EGFR还能促进肿瘤部位新生血管的形成，而促进肿瘤的生长和转移[7]。人类的多种肿瘤细胞中也可见EGFR和其配体的高表达[8]。临床研究显示，针对EGFR的药物和单克隆抗体能够抑制肿瘤细胞的增殖[9]。因此，EGFR是与肿瘤生长明显相关的膜分子。为探讨CKLFSF8转染后细胞的增殖被抑制的可能机制，我们研究了转染后细胞表面EGFR的表达，结果显示CKLFSF8质粒转染HL60细胞后EGFR表达明显降低，与对照组相比，有显著差异。

　　实验结果表明，趋化因子CKLFSF8基因可在HL60细胞株中表达，转染该基因后白血病细胞过表达这种趋化因子，且该基因对HL60细胞表面EGFR的表达有明显抑制作用，这提示CKLFSF8可能通过抑制HL60细胞EGFR的表达而达到抑制HL60细胞生长的作用。

　　目前对于这种新型趋化因子的结构已经有了比较深入的了解，但是对于它的功能研究很少，后续还需作许多体内外相关实验，比如趋化实验、动物实验等，以便对这种新型趋化因子有更全面深入的了解，为这种新型趋化因子的应用打下坚实的理论基础。从对这种新型趋化因子的现有研究结果来看，有望对白血病的治疗提供新的思路。

　　【参考文献】

　　1Murooka TT, Ward SE, Fish EN. Chemokines and cancer. Cancer Treat Res, 2005; 126:15-44

　　2Lou Y, Xia D, Han W, et al. Molecular cloning and characterization of rat chemokinelike factor 1 and 2. Gene, 2003; 307: 125-132

　　3Mantovani A. The chemokine system: redundancy for robust outputs. Immunol Today, 1999; 20: 254-257

　　4徐明旭,程宁,杨松桦等. CKLFSF1 基因与CKLFSF2 基因间存在的顺式作用元件. 中国生物化学与分子生物学报，2003; 19 :349-353

　　5Han W, Lou Y , Tang J , et al. Molecular cloning and characterization of chemokinelike factor 1 (CKL F1), a novel human cytokine with unique structure and potential chemotactic activity. Biochem J , 2001; 357(Pt 2):127-135

　　6Han W, Ding P, Xu M, et al. Identification of eight genes encoding chemokinelike factor superfamily members 18 (CKLFSF18) by in silico cloning and experimental validation. Genomics, 2003; 81: 609-617

　　7Odintsova E, Sugiura T, Berditchevcski F, et al. Attenuation of EGF receptor signaling by a metastasis suppressor, the tetraspanin CD82/KAI1 . Curr Biol, 2000; 10:1009-1012

　　8Zheng B, Lavoie C, Tang TD, et al. Regulation of epidermal growth factor receptor degradation by heterotrimeric Galphas protein. Mol Biol Cell, 2004; 15:5538-5550