重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL 60细胞的促凋亡作用

　　作者：高丽,李玉英,张政,王转花,王宏伟　　作者单位：山西大学生物技术研究所，教育部化学生物学和分子工程重点实验室，

　　【摘要】为了研究基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂诱导HL60细胞凋亡的作用并探讨其抗癌作用机理，用不同浓度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂体外作用于HL60细胞，采用MTT比色法检测其对HL60细胞的抑制率，应用光学显微镜观察细胞核的形态学变化，用DNA凝胶电泳法检测HL60细胞的凋亡，用流式细胞术检测该抑制剂作用于HL60细胞后引起的凋亡现象。 结果表明：重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL60细胞的生长具有明显的抑制作用，且随着蛋白质浓度的增加对HL60细胞生长抑制愈加明显，而对正常人外周血单个核细胞(PBMNC)无作用; 荧光显微镜下观察发现经该蛋白作用后HL60细胞核的形态呈现凋亡特征;流式细胞术分析表明，HL60细胞经100 μg/ml 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂作用后，凋亡率达到52%;琼脂糖凝胶电泳显示细胞DNA呈梯状降解。结论： 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂在体外能够明显抑制HL60细胞的增长，并诱导细胞凋亡，这为重组荞麦胰蛋白酶抑制剂应用于急性髓细胞性白血病的治疗提供依据，也为重组基因工程植物蛋白药物的临床应用提供新思路。

　　【关键词】 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂,HL60细胞,细胞凋亡

　　Abstract The study was purposed to investigate the apoptosis of HL60 cells induced by recombinant common buckwheat trypsin inhibitor (rBTI)and its mechanism. The inhibition rate of rBTI on HL60 cells was detected by MTT (3[4, 5 dimethylthiazol2yl]2, 5diphenyltetrazolium bromide); the morphology of HL60 nuclei was observed by fluorescence microscopy; the apoptosis cells of HL60 detected by agarose gel electrophoresis and the changes of apoptosis rate was assayed by flow cytometry (FCM), when the HL60 cells were treated with different concentration of rBTI for 24 hours. The results showed that the growth of HL60 cells was inhibited evidently after treatment with rBTI in a dosedependent manner, but there were minimal effects on normal human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). The nuclei of HL60 cells showed the characteristics of apoptosis, the analysis by flow cytometry indicated that the apoptosis rate of HL60 cells was 52% after treatment with rBTI (100 μg/ml), DNA analyzed by agarose gel electrophoresis showed "ladder" pattern. It is concluded that rBTI obviously inhibits growth of HL60 and induces its apoptosis which provides a foundation for use of recombinant common buckwheat trypsin inhibitor to cure the acute myeloid leukemia.

　　Key words recombinant buckwheat trypsin inhibitor; HL60 cell; apoptosis

　　J Exp Hematol 2007; 15(1):59-62

　　细胞凋亡在维持机体处于稳定状态中起着重要作用，细胞凋亡异常与人体多种恶性肿瘤的发生发展过程密切相关。细胞内蛋白酶及其抑制剂可能在细胞凋亡的启动方面起着关键性作用[1]，以选择性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的凋亡干预技术可能成为治疗恶性肿瘤的基本策略。白血病是严重危害人类健康的恶性血液病，化疗虽然是目前主要的治疗手段， 但其副作用及耐药性已成为临床上治疗白血病的极大障碍。因此，寻找新型有效的防癌，抗癌药物迫在眉睫[2]。 蛋白酶抑制剂是生物体内的防御蛋白之一， 作为一种潜在的抗肿瘤药物，近年来受到国内外相关研究者的普遍关注[3]。体外实验研究发现，来自大豆和其他豆类中的BowmanBirk型胰蛋白酶抑制剂能够诱导结肠癌肿瘤细胞凋亡[4]。

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(1)重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL60细胞的促凋亡作用荞麦是一种古老的小宗杂粮作物，由于它的化学和生物学成分独特，目前在食品和医药方面有着广泛的应用。研究表明，荞麦中的生物类黄酮和胰蛋白酶抑制剂似有抑制癌细胞的生长作用[5]，但详细研究尚未见报道。 本实验室采用基因重组技术，获得了一种重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(recombinant common buckwheat trypsin inhibitor，rBTI)，对其理化性质及抑制活性分析显示，重组荞麦胰蛋白酶抑制剂与天然荞麦胰蛋白酶抑制剂的作用基本一致[6]。 为了了解荞麦胰蛋白酶抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡的可能性，我们研究了重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂对白血病细胞HL60的诱导凋亡作用，为探讨其抗癌作用机理奠定了基础。

　　材料和方法

　　材料和试剂

　　RPMI 1640培养液为美国 Hyclone 产品，人急性髓细胞性白血病细胞株HL60由中国辐射防护研究院二所惠赠，小牛血清为杭州四季青公司产品， 四甲基偶氮唑蓝(MTT)为Sigma公司产品， Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒为PharMingenBecton Dickinson公司产品，DNA ladder 检测试剂盒购自南京凯基生物公司，其他试剂均为国产分析纯。

　　细胞培养

　　HL60细胞在含10%-15%的小牛血清,15 mmol/L HEPES, 8 U/ml的庆大霉素的RPMI 1640的完全培养液中，于37℃、5% CO2孵育箱中培养，细胞呈半悬浮生长，2-3天传代1次。正常的人外周血单个核细胞(PBMNC)在相同培养基和环境中培养。取对数生长期的细胞进行实验。

　　rBTI抑制HL60细胞生长的MTT检测[7]

　　取处于对数生长期的HL60细胞，调整细胞浓度至1×106/ml, 每孔加入100 μl细胞液，接种于96孔培养板中，分别加入不同浓度的rBTI溶液，终浓度分别为12.5、25、50和100 μg/ml, 每组各设3个复孔，同时做正常细胞对照孔。37℃、5% CO2培养24 小时，每孔加入20 μl MTT(5.0 mg/ml)，继续培养4小时后倒去板中的培养液，每孔加入80 μl的DMSO溶解结晶物，于490 nm处测定各孔光吸收值。

　　HL60细胞核的形态学观察

　　HL60细胞在96孔板中经终浓度为100 μg/ml rBTI处理24小时后，收集细胞，用预冷的磷酸缓冲溶液(20 mmol/L pH 7.3)洗涤后重悬于固定液(4% 多聚甲醛)中。10分钟后，悬液慢速离心，收集沉淀，用同样缓冲溶液洗涤2次。之后将细胞悬液滴到载玻片上，用0.1 μg/ml的Hoechst 33258染色5分钟。在荧光显微镜下观察细胞核的形态学变化。

　　细胞凋亡率的流式细胞术分析

　　收集不同浓度(12.5-100 μg/ml)rBTI处理后的细胞(1×106/ml)并重悬于结合缓冲液(binding buffer)中，700×g离心10分钟，用binding buffer再次悬起细胞，加荧光标记液Annexin V和PI，室温闭光孵育15分钟，流式细胞仪检测。

　　DNA的凝胶电泳检测

　　按照凯基公司的DNA提取操作说明书进行。经不同浓度(12.5-100 μg/ml)的rBTI处理后的细胞(1×106/ml)用PBS 洗涤， 3 400×g， 4℃ 离心5分钟，收集细胞，按比例每(1-10)×105个细胞加入100 μl裂解液，冰上放置5-10分钟，离心，收集上清液，加入10 μl 10%的SDS，2 μl RNase A，混匀，于37℃放置1小时。加入2 μl 蛋白酶 K，于37℃放置2小时，再依次加入1 μl核酸助沉剂，12 μl 3 mol/L醋酸钠，250 μl无水乙醇，混匀，-20℃孵育30分钟。 9 500×g离心10分钟，弃上清，室温干燥沉淀。获得的DNA用双蒸水溶解后经 1% 琼脂糖凝胶电泳并进行凝胶成像分析。

　　结 果

　　rBTI对HL60细胞生长的抑制作用

　　用MTT比色法检测 rBTI对HL60细胞增殖抑制发现，抑制效率具有剂量依赖性。在12.5-100 μg/ml范围内，rBTI能明显抑制HL60细胞的增长，随药物浓度的增加，抑制作用逐渐增强 (图1)。但对正常的的人PBMNC的作用很小。100 μg/ml rBTI体外诱导HL60细胞24小时后，HL60细胞抑制率达到 51%，而对PBMNC的抑制率只有11.1%。各实验组与正常对照组比较均有显著性差异或极显著性差异(P<0.05, 或P <0.01)。

　　细胞核的形态学观察

　　HL60细胞经100 μg/ml rBTI处理24小时后用Hoechest33258染色，出现了凋亡信号(图2A)，与对照组相比，细胞核出现碎裂，形状不规则，少量伴有凋亡小体(图2B)。

　　DNA的凝胶电泳分析

　　细胞凋亡晚期时，DNA会被核酸酶在核小体连接处切断，产生200 bp或200 bp整倍数大小的DNA片段，琼脂糖凝胶电泳时呈现梯状条带。这是细胞凋亡的最典型特征。实验结果显示，经rBTI(浓度为0-100 μg /ml)处理的HL60细胞DNA 呈现梯状条带，而且随着rBTI浓度的增加，DNA梯状条带越来越清晰。而对照组电泳条带依然在点样孔附近，并未出现“梯状”现象(图3)。Figure 3. Internucleosomal DNA fragmentation in HL60 cells treated with or without rBTI for 24 hours. Lane 1 and 6: no treatment. Lane 2: 12.5 μg/ml rBTI. Lane 3: 25.0 μg/ml rBTI. Lane 4: 50.0 μg/ml rBTI. Lane 5: 100 μg/ml rBTI.

　　HL60细胞凋亡率的变化

　　流式细胞术检测表明，细胞凋亡早期细胞膜虽未破裂，但出现了一些明显改变，其中最明显的变化是细胞膜磷脂双分子层中的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)从细胞膜内翻转到细胞膜外。Annexin V与PS有很高的亲和力，Annexin V被荧光素(FITC)标记，可在流式仪上检测到早期凋亡的细胞。本实验结果表明，经不同浓度rBTI处理的HL60细胞出现了不同程度的凋亡。而且随着浓度的增加，凋亡程度也越来越明显。由图4可以看出，当rBTI的浓度从12.5 μg/ml增加到100 μg/ml时，细胞凋亡率分别为14.1%, 20.7%, 35.2%, 52.1%，即IC50为100 μg/ml，与MTT结果基本相吻合。

　　讨 论

　　蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor, PI)以多种形式普遍存在于动、植物以及微生物中，它参与生物体内蛋白酶活性的调节、信号受体的相互作用及逆境情况(如外界损伤)下的应答等生理过程。 近年来，各种肿瘤病和血液病的发生率逐年增高，但是抗肿瘤药物的数量还相对较少，为了寻找新型而有效的抗肿瘤药物，许多研究者进行了大量实验，并发现生物体内的蛋白酶抑制剂具有潜在的抗肿瘤作用[8，9]，一种或多种蛋白酶及蛋白酶抑制剂可能在细胞凋亡发生、发展过程中起关键性作用[10]。这些研究为抗肿瘤药物的研制提供了新的靶标，而分子生物学与基因工程技术的发展，也为新型生物技术药物的理论研究、应用研究和产业化生产提供了手段。目前我国自主研制的重组蛋白酶抑制剂抗肿瘤药物尚属空白。

　　本研究以我室先前获得的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂为材料，研究基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)诱导HL60细胞凋亡的作用，结果表明: 来自蓼科植物的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂能够有效的抑制HL60肿瘤细胞的生长，并随药物浓度的逐渐增加，抑制作用也明显增强，呈剂量依赖性，但对正常外周血单个核细胞的生长没有影响。流式细胞术检测结果显示，经不同浓度rBTI处理的HL60细胞出现了不同程度的凋亡，最终抑制HL60细胞的增殖，这说明重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对急性髓细胞性白血病细胞株HL60有一定的抑制增长作用。然而，rBTI诱导HL60细胞凋亡的机理有待深入研究。本研究为植物小分子蛋白酶抑制剂在抗肿瘤方面的应用提供了新内容，也为基因重组植物蛋白药物的临床应用开创新的思路。进一步研究这类药物有望使其成为一种理想的抗肿瘤靶向治疗药物。

　　【参考文献】

　　1陈泽涛, 董倩. 抗癌中药与细胞凋亡研究. 山东中医药大学学报, 1999; 23: 74-77

　　2许凯黎. 细胞凋亡基因异常调控在肿瘤和肺癌发生及发展中的研究进展.中国癌症杂志, 1997; 7: 4-6

　　3Supuran CT, Casini A, Scozzafava A. Protease inhibitors of the sulfonamide type: anticancer, antiinflammatory, and antiviral agents. Med Res Rew, 2003; 23: 535-558

　　4Yavelow J, Finlay TH, Kennedy AR, et al. BowmanBirk soybean protease inhibitor as an anticarcinogen. Cancer Res, 1983; 43(5 Suppl): 2454s-2459s

　　5Ren W, Qiao Z, Wang H, et al. Molecular basis of Fas and cytochrome c pathways of apoptosis induced by tartary buckwheat flavonoid in HL60 cells. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 2003; 25: 431-436

　　6李晨, 张政, 李玉英等. 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂理化性质的研究.食品科学, 2006; 8：52-56

　　7兰雨，张学敏， 杨平地等. 蛋白酶体抑制剂可增加足叶乙甙对白血病细胞系M07e和TF1的凋亡诱导效应. 中国实验血液学杂志，2003; 5: 485-489

　　8Foehr MW, Tomei LD, Goddard JG, et al. Antiapoptotic activity of the BowmanBirk inhibitor can be attributed to copurified phospholipids. Nutr Cancer, 1999; 34: 199-205

　　9Inoue K, Takano H, Yanagisawa R, et al. Protective role of urinary trypsin inhibitor in acute lung injury induced by lipopoly saccharide. Exp Biol Med, (Maywood) 2005; 230: 281-287

　　10李丽琴， 郑晓军，陈乐贵. 蛋白酶体抑制剂药理活性的研究进展. 国外医学•药学分册, 2001; 28: 132 - 136