rAAV 2-GPⅡb/GPⅢa载体构建和体外表达、功能实验

　　作者：王凯,彭建强,陈方平,吴小兵　　作者单位：中南大学湘雅医院血液科，长沙 410008;

　　【摘要 】为了研究rAAV载体介导的血小板无力症基因治疗的可行性，构建了由CMV启动子调控的rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa病毒载体，并采用多种方法验证了rAAV2-Ⅱb和rAAV2-Ⅲa病毒载体在真核细胞中的表达能力，其中包括用RT-RCR方法检测BHK-21细胞感染24小时(MOI=1×105 v.g/cell)后目的基因在mRNA水平的表达，用流式细胞术的方法检测不同MOI和目的基因表达之间的量效关系，采用Western blot的方法检测BHK-21细胞感染48小时后(MOI=1×105 v.g/cell)目的基因在蛋白水平的表达，用免疫荧光法检测BHK-21细胞感染48小时后(MOI=105 v.g/cell)目的基因在细胞表面的表达，以及应用PAC-I结合试验验证所表达的GPⅡb/Ⅲa蛋白功能。结果表明，在MOI=1×105 v.g/cell条件下，在BHK-21细胞感染24小时后即可在mRNA水平上检测到目的基因的表达，在48小时可在蛋白水平检测到目的基因的表达;在一定剂量范围内目的基因的表达量随着MOI的增加而增加，但MOI过高反而使表达量下降，目的基因表达产物活化之后能与PAC-I结合，并具有正常的生物学活性。结论：rAAV2载体能有效地介导GPⅡb、GPⅢa基因在真核细胞内表达，所表达的产物都具有正常的生物学活性，此结果为rAAV2载体在血小板无力症基因治疗中的应用打下了基础。

　　【关键词】 腺相关病毒载体

　　Abstract This study was aimed to explore the possibility of rAAV2 vector-mediating gene therapy for Glanzmann′ s thrombasthenia.The rAAV2-GPⅡb/Ⅲa vector was constructed. The GPⅡb/Ⅲa gene expression in mammal cell were examined by different methods，such as: detection of mRNA expression in BHK-21 cells after 24 hours of infection (MOI=1×105 v.g/cell) was performed by RT-PCR; the relation between MOI and quantity of GPⅡ6/Ⅲa gene expression was detected by FACS after 48 hours of infection; GPⅡb/Ⅲa protein expression in BHK-21 cells after 48 hours of infection (MOI=105 v.g/cell) was assayed by Western blot，GPⅡb/Ⅲa protein expression on cell surface was detected by immunofluorescence，and the biological function of expressing product was determined by PAC-1 conjunct experements.The results showed that GPⅡb/Ⅲa gene expression in mRNA level could be detected in BHK-21 cells after 24 hours of infection at MOI=1×105 v.g/cell and the GPⅡb/Ⅲa gene expression in protein level could be detected in BHK-21 cells after 48 hours of infection at MOI=1×105 v.g/cell.In certain range，quantity of GPⅡb/Ⅲa gene expression increased with MOI，but overdose of MOI decreased quantity of GPⅡb/Ⅲa gene expression.Activated product of GPⅡb/Ⅲa gene expression could combined with PAC-I，and possesed normal biological function.In conclusion，rAAV2 vactor can effectively mediate GPⅡb and GPⅢa gene expressing in mammal cells，and the products of these genes exhibit biological function.This result may provide a basis for application of rAAV2 vector in Glanzmann’s thrombasthenia gene therapy in furture.

　　Key words rAAV2 vector; Glanzmann′s thrombasthenia; GPⅡb/Ⅲa

　　血小板无力症(Glanzmann′s thrombasthenia GT)是一种常染色体隐性遗传疾病，是一种由于先天性血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa基因缺陷，使得血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa异常，引起血小板聚集功能异常而导致的一种出血性疾病[1]，其主要的临床症状是自幼的皮肤、粘膜出血，表现为皮肤瘀斑、 鼻出血、月经过多等等。GT分为两型：I型GT血小板对纤维蛋白完全没有反应，血块不能退缩，血小板表面的GPⅡb/Ⅲa小于 5%;Ⅱ型GT对纤维蛋白有部分反应，血小板表面仍存在10%-20%的GPⅡb/Ⅲa[2]。此外，Nurden等[3]和Fournier等[4]先后报道了一种变异型的GT，这类患者血小板表面的GPⅡb/Ⅲa量正常或接近正常(60%-100%)，但是一种无功能受体。临床上的常规治疗手段，如血小板输注，只能在短期内缓解出血症状，无法治愈;异体造血干细胞移植虽能有效地治疗本病，但是配型问题和移植风险限制了它的使用。基因治疗将正常的GPⅡb或Ⅲa基因导入患者体内从根本上纠正病因，将是一种治疗血小板无力症的有效手段。

　　在基因治疗过程中基因治疗载体的选择至关重要，它直接影响治疗效果。重组腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体是一种目前研究较多的病毒载体。 与其他病毒载体相比，重组腺相关病毒载体具有安全性好、宿主细胞广泛(可感染多种分裂细胞和非分裂细胞)、免疫原性低、能够介导外源基因长期稳定表达等优势。目前，在国际上已开发出多种血清型重组腺相关病毒载体，它们各自具有不同转导特性。本研究选择了血清型2的重组腺相关病毒载体作为血小板无力症基因治疗载体，探索血小板无力症的基因治疗的可能性。

　　材料和方法

　　试剂

　　十二烷基磺酸钠(SDS)、Tris碱(Sigma产品);LB培养基(自配)，Taq DNA聚合酶及PCR相应试剂、T4 DNA 连接酶、T4 DNA 聚合酶、 RNase A、 DNA限制性内切酶(TaKaRa公司)，琼脂糖(Promega公司)，质粒小量提取试剂盒Plasmid Kits(道普公司);RPMI 1640(Gibco BRL公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，真核细胞转染试剂Lipofectamine(Gibco BRL公司)，TrizoL(Invitrogen公司)，反转录试剂盒(Promega公司)，Ⅱb、Ⅲa PCR引物(北京奥科公司合成)，PBS-T、电转液(自配)，FITC-CD41抗体(Biolegend公司)，FITC-CD61抗体(Southern Biotech公司)，FITC-IgG抗体(晶美公司)，FITC-PAC-1抗体(Becton Dickinson公司)，PMI-1抗体和7H2抗体由美国Coller教授惠赠。

　　仪器

　　PCR扩增仪(FTgene20 美国TechgeneE公司)，CO2培养箱(Heraeus 公司)，台式高速冷冻离心机(Heraeus 公司)，倒置显微镜(Leica DLIL 德国Leica公司)，凝胶成相系统(Amersham pharmacia biotech ImageMaster VDS)，转膜仪。

　　细胞

　　金黄地鼠胚胎肾细胞BHK-21(美国ATCC)。

　　质粒

　　pcDNA3.1(-)-Ⅲa质粒由美国Wilcox教授惠赠，TBF Ⅱb质粒由本室傅敢博士构建。

　　载体质粒pSNAV-Ⅱb、pSNAV-Ⅲa的构建

　　pSNAV-Ⅱb质粒的构建 将pSNAV质粒用EcoR I切开，T4 DNA聚合酶补平，回收;将载体片段连接Xba I接头，转化E.coli DH5a感受态细菌;挑选重组菌落，获得pSNAV-Xba I载体。用Xba I + Nhe I双酶切TBF Ⅱb质粒，回收3 kb目的片段，插入pSNAV-Xba I载体上的Xba I位点。

　　pSNAV-Ⅲa质粒的构建

　　将pSNAV质粒用EcoR I切开，回收;用EcoR I单切pcDNA3.1(-)-Ⅲa质粒，回收3.7 kb目的片段。插入pSNAV载体上的EcoR I位点。

　　重组rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa病毒制备

　　根据吴小兵等研究的rAAV2制备方法[5]，将2个质粒pSNAV-Ⅱb、pSNAV-Ⅲa用道普公司质粒小量提取试剂盒提取并鉴定后，用Lipofectamine 分别转染至BHK-21细胞，800 μg/ml G418选择培养获得重组质粒的载体细胞株。转瓶扩大培养，用辅助病毒rAAV2 HSV1-rc/ΔUL2感染(MOI为0.1)。48小时细胞完全病变、容易脱落时，收获病毒，柱纯化后保存于 4℃。

　　rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa病毒表达

　　RT-PCR分析

　　将BHK-21细胞分入6孔板，每孔5×105细胞，设rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa两组，用含10%血清RPMI 1640培养液培养3-4小时，使细胞贴壁伸展。按1×105 viral genomes (v.g)/cell分别加入rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa病毒，对照孔加入rAAV2-LacZ病毒作为对照病毒。感染时培养液体积为500 μl，置37℃培养箱吸附1小时后，去掉上清，加入含10%血清的RPMI 1640培养液继续培养24小时。TrizoL提取总RNA，使用随机引物进行反转录，取反转录产物进行PCR。血小板RNA作为阳性对照。

　　采用的PCR引物如下：

　　GPⅡb：F-5′-CGAGTTCGACGGGGA TCTCAAC-3′ ;B-5′-AAAGGCAGAGCC TGTGGGGAAG-3′ ;

　　GPⅢa：F-5′-GAAGGCTGGCAGGCATT GTC-3′ ;B-5′-CGATCAGGCTGTCCTT GAAG-3′

　　流式细胞术分析

　　将BHK-21细胞分入6孔板，每孔5×105细胞，用含10%血清RPMI 1640培养液培养培养3-4小时，使细胞贴壁伸展。检测分为rAAV2-Ⅱb和rAAV2-Ⅲa两大组，每组中再分4×103 v.g./cell、2×104 v.g./cell、1×105 v.g./cell、5×105 v.g./cell和空白对照5个小组，每小组设3个复孔。按1×105v.g./cell分别加入rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa病毒，对照孔加入rAAV2-LacZ病毒。感染时培养液体积为500 μl，置37℃培养箱吸附1小时后，去掉上清，加入含10%血清的RPMI 1640继续培养48小时。收获孔板中的细胞，分别加入FITC-CD41、FITC-CD61、FITC-IgG，避光孵育30分钟，用PBS洗涤2次，上机检测。

　　Westen blot分析

　　将BHK-21细胞分入25 cm2培养瓶，检测分rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa 2组，用含10%血清RPMI 1640培养液培养3-4小时，使细胞贴壁伸展。按1×105 v.g./cell分别加入rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa病毒，对照组加入rAAV2-LacZ 病毒。感染时培养液体积为1 ml，置37℃培养箱吸附1小时后，去掉上清，加入含10%血清的RPMI 1640继续培养48小时。48小时后，用PBS洗涤细胞2次，每瓶细胞加入细胞裂解液800 μl，孵育30分钟，细胞刮收样，超声处理裂解后的细胞悬液，BCA定量。取20 μg蛋白180 V稳压电泳一个小时，200 W转膜2小时;5%脱脂牛奶37℃封闭2小时，一抗4℃杂交过夜;洗膜，AP标记二抗，37℃杂交2小时;洗膜显色。取血小板破碎液作为阳性对照。

　　免疫荧光分析

　　将BHK-21细胞分入预放置灭菌盖玻片的6孔板，每孔1×106细胞，检测分rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa两组，用含10%血清RPMI 1640培养液培养3-4小时，使细胞贴壁伸展。按1×105 v.g./cell分别加入rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa病毒，对照孔加入rAAV2-LacZ病毒。感染时培养液体积为500 μl，置37℃培养箱吸附1小时后，去掉上清，加入含10%血清的RPMI 1640继续培养48小时。取出爬满细胞的盖玻片，无水乙醇固定30分钟，用PBS洗片。加入封闭液37℃湿盒封闭1小时。洗片，加入荧光一标抗体10 μl，37℃湿盒孵育1小时。洗片，荧光显微镜观察照像。

　　PAC-1结合实验

　　将含有载体质粒pSNAV-Ⅱb、pSNAV-Ⅲa的BHK细胞分别分入6孔板，每孔5×105细胞。用含10%血清RPMI 1640培养液培养3-4小时，使细胞贴壁伸展。分别用rAAV2-Ⅱb感染含含有载体质粒 pSNAV-Ⅲa的BHK细胞;用rAAV2-Ⅲa感染含有载体质粒 pSNAV-Ⅱb的BHK细胞。感染时培养液体积为1 ml，置37℃培养箱吸附1小时后，去掉上清，加入含10%血清的RPMI 1640继续培养48小时。收获孔板中的细胞在含8 μmol/L ADP缓冲液中25℃孵育15分钟。分别加入FITC-PAC-1、FITC-IgG抗体避光孵育30分钟，用PBS洗涤细胞2次，上机检测。

　　结 果

　　GPⅡb/Ⅲa 基因表达RT-PCR检测

　　rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa 感染BHK-21细胞24小时后的RT-PCR分析均出现500 bp的目的条带，对照病毒rAAV2-LacZ感染后的RT-PCR分析没有出现500 bp的目的条带。这说明BHK-21细胞在感染rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa病毒后均能在mRNA水平检测到GPⅡb、GPⅢa基因的表达。GPⅡb/Ⅲa表达结果见图1。

　　Figure 1.Amplification of GPⅡb (A) and GPⅢa (B) by RT-PCR. M: DL2000 Mark(2000 1000 750 500 250 100).Lane 1: rAAV2-Ⅱb/Ⅲa virus group.Lane 2: positive control.Lane 3: rAAV2-LacZ virus group.rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa病毒感染BHK-21细胞后流式细胞术检测

　　各个剂量组rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa 感染BHK-21细胞后均能在细胞膜表面检测到CD41、CD61分子的表达。表达量在一定范围内随着病毒感染复数(MOI)的增高而增高，在MOI为1×105v.g./cell(病毒基因组/细胞)时表达量最高，但是MOI 再增大后CD41、CD61分子的表达反而有所下降。对照病毒rAAV2-LacZ感染后检测不到GPⅡb/Ⅲa表达。结果见图2。

　　GPⅡb/Ⅲa 蛋白Westen blot分析

　　在rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa 感染BHK-21细胞48小时后的细胞裂解液中能检测到目的蛋白GPⅡb、GPⅢa的表达，说明rAAV2能有效地介导GPⅡb/Ⅲa基因在真核细胞中的表达(图3)。

　　免疫荧光分析

　　rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa 感染BHK-21细胞48小时后可见细胞表面表达有GPⅡb/Ⅲa蛋白，结果见图4，5。

　　PAC-1结合实验

　　rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa在感染含对应质粒BHK-21株48小时后，经ADP刺激，具有结合PAC-1抗体的能力，阳性细胞比例分别为11.4%和14.1%，说明rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa所表达的GPⅡⅡb/Ⅲa具有生物学活性，结果见图6，7。

　　讨论

　　血小板无力症是由瑞士儿科医生Glanzmann[6]在1918年首先报道的一种先天性出血性疾病，患者的出血时间延长，血块退缩不良。随后的研究发现，它是一种常染色体隐性遗传疾病，其基础病变在于血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa基因异常，使得GPⅡb/Ⅲa缺乏或者功能异常。血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa为血小板表面纤维蛋白受体，它们的缺乏或功能异常使得血小板聚集功能丧失，在II期生理止血过程中不能有效地形成血小板栓而导致出血[7]。到目前为止，已发现50多种GPⅡb/Ⅲa基因异常，这些异常包括点突变、片断缺失、片断倒转等[8]。这些突变发生在GPⅡb或者GPⅢa基因的频率大致相当，通常只有纯合子或双重杂合子才会发病。血小板无力症的病因明确，为一单基因病，是良好的基因治疗研究对象。

　　1999年Wilcox等[9，10]就应用逆转录病毒载体开始了对血小板无力症进行体外修饰基因治疗的相关研究，并取得了令人瞩目的成绩。他们所构建的由GPⅡb启动子调控的逆转录病毒载体不仅在巨核细胞株上取得良好的表达效果，而且在患者干细胞水平也得到令人满意的结果。但是，两个接受逆转录病毒基因治疗的SCID患儿发生白血病的事件，给逆转录病毒载体应用的安全性问题提出了质疑[11-13]。我们除了对逆转录病毒载体本身进行更深入研究外，也需要寻找其他可能的基因治疗载体。腺相关病毒载体是目前研究应用较多的一种病毒载体。它相对于其他病毒载体的优势在于：①安全性好，迄今未发现野生型AAV与任何人类疾病相关[14-16];②宿主广泛，可感染分裂细胞和非分裂细胞包括肺[17]、肝脏[18，19]、脑[20，21]和肌肉细胞[22-24]在内的非分裂细胞，在本室前期的一些研究中认为rAAV2病毒载体对造血干细胞也有一定的感染效率[25];③能够介导外源基因的长期稳定表达，有研究表明，AAV载体介导外源基因在动物体内可持续表达两年以上;④免疫原性低，可多次给药。基于此，我们构建了由CMV启动子调控表达的rAAV2病毒载体rAAV2-GPⅡb和rAAV2-GPⅢa，探讨rAAV2载体在血小板无力症的基因治疗中的应用。

　　在我们的实验中，BHK-21细胞在感染病毒24小时后用RT-PCR分析即可检测到500 bp的目的条带，而作为对照病毒的rAAV2-LacZ感染后无法检测到相应目的条带，说明从mRNA水平能够检测到两个目的基因的表达。在病毒感染BHK-21细胞48小时后的Westen blot分析和免疫荧光分析均能明确检测到GPⅡb/Ⅲa蛋白的表达。而在使用流式细胞术所进行的量效关系分析中我们发现，在一定范围内GPⅡb/Ⅲa基因的表达随着病毒剂量(MOI)的增大而增大，但是当MOI达到一定程度后GPⅡb/Ⅲa基因的表达不再增高，并有所下降。我们分析认为是由于细胞表面rAAV2病毒受体饱和，载体本身之间的竞争性抑制所引起。我们的研究证明，rAAV2病毒载体能够有效的介导GPⅡb基因和GPⅢa基因在真核细胞中的表达，在MOI为1×105v.g/cell的时候GPⅡb/Ⅲa蛋白表达量达到最大。同时，为了证明所表达基因的功能，我们设计了PAC-1结合实验。PAC-1是一种特异性激活型单克隆抗体IgMk，它只能结合活化的GPⅡb/Ⅲa复合物，而对静息状态下的GPⅡb/Ⅲa没有结合能力[26，27]。我们通过rAAV2-GPⅡb、rAAV2-GPⅢa感染含有pSNAV-Ⅱb/pSNAV-Ⅲa载体质粒的BHK-21细胞的方法在BHK-21细胞表面表达出GPⅡb/Ⅲa复合物(因为含有pSNAV-Ⅱb/pSNAV-Ⅲa载体质粒细胞株的细胞表面能表达出所含载体质粒的目的基因)，利用合适的GPⅡb/Ⅲa激动剂(我们采用的是ADP)激活GPⅡb/Ⅲa复合物，从而达到检测目的基因功能的目的。从我们的实验结果来看，rAAV2-GPⅡb和rAAV2-GPⅢa所表达的GPⅡb/Ⅲa复合物在经ADP活化后都具有与PAC-1抗体结合的能力，说明所表达的GPⅡb/Ⅲa具有生物学活性。在我们的结果中，PAC-1阳性的细胞比例明显小于同感染复数下GPⅡb/Ⅲa的表达水平，其原因主要有：第一 rAAV2-GPⅡb和rAAV2-GPⅢa本身在 含有pSNAV-Ⅱb/pSNAV-Ⅲa载体质粒的BHK-21细胞中的表达效率低于空BHK-21细胞株;第二含有pSNAV-Ⅱb/pSNAV-Ⅲa载体质粒的BHK-21细胞并不是100%表达载体所携带的外源基因，因此即使细胞表面有rAAV2介导的基因表达，并不一定能够在细胞表面形成GPⅡb/Ⅲa复合物。为此，我们还是认为rAAV2所表达的GPⅡb、GPⅢa 均有生物学活性。

　　在本研究中，我们构建了由CMV启动子调控的rAAV2-GPⅡb和rAAV2-GPⅢa。从研究的结果来看rAAV2能有效地介导GPⅡb、GPⅢa基因在真核细胞内表达，并且所表达的产物都具有正常的生物学活性。我们的研究证明，rAAV2是适用于血小板无力症基因治疗的良好载体，为今后rAAV2载体在血小板无力症的基因治疗中的应用打下了良好的基础。

　　【参考文献】

　　1 陈方平，Coller BS，French D 等.用单链构型多态性分析快速检测血小板膜GPⅡb/Ⅲa基因变异.中华医学杂志，1995; 75:341-343

　　2 Caen JP.Glanzmann`s thrombasthenia.Baillieres Clin Haematol，1989; 2: 609-625

　　3 Nutden AT，Rosa JP，Fournier D，et al. A variant of Glanzmann′ s thrombasthenia with abnormal GPⅡb-Ⅲa complexes in the platelet membrane.J Clin Ivest，1987; 79: 962-969

　　4 Fournier DJ，Kabral A，Castaldi PA，et al. A variant of Glanzmann`s thrombasthenia characterized by abnormal glycoprotein Ⅱb/Ⅲa complex formation.Thromb Haemost，1989; 62: 977-983

　　5 伍志坚，吴小兵，曹晖等.一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统. 中国科学•C辑，2001;31： 423-430

　　6 Glanzmann E.Hereditare Hemorrhagische Thrombasthenie: Ein Beitrag zur Pathologie der Blut Plattchen.J Kinderkr，1918; 88:113

　　7 Burgess-Wilson ME，Cockbill SR，Johnston GI，et al. Platelet aggregation in whole blood from patients with Glanzmann′ s thrombasthenia.Blood，1987; 69: 38-42

　　8 George JN，Caen JP，Nurden AT. Glanzmann′ s thrombasthenia: the spectrum of clinical disease.Blood，1990; 75:1383-1395

　　9 Wilcox DA，Olsen JC，Ishizawa L，et al. Integrin alphaⅡb promoter-targeted expression of gen products in magakaryocyte derived from retrovirus-transduced human hematopoietic cells.Proc Natl Acad Sci USA，1999; 96: 9654-9659

　　10 Wilcox DA，Olsen JC，Ishizawa L，et al. Megakaryocyte-targeted synthesis of integrin betal3-subunit results in the phenotypic correction of Glaznmann thrombasthenia.Blood，2000; 95: 3645-3651

　　11 Kohn DB，Sadelain M，Glorioso JC.Occurrence of leukaemia following gene therapy of X-linked SCID.Nat Rev Cancer，2003; 3: 477-488

　　12 Haviernik P，Bunting KD.Safety concerns related to hematopoietic stem cell gene transfer using retroviral vectors.Curr Gene Ther，2004; 4:263-276

　　13 Kang EM，Tisdale JF.The leukemogenic risk of integrating retroviral vectors in hematopoietic stem cell gene therapy applications.Curr Hematol Rep，2004; 3:274-281

　　14 Blacklow NR，Hoggan MD，Sereno MS，et al. A seroepidemiologic study of adenovirus-associated virus infection in infants and children.Am J Epidemiol，1971; 94: 359-366

　　15 Blacklow NR.Adeno-associated virus of humans.In: Pettison J (eds.). Parvovirus Hum Dis.1988: 165-174

　　16 Blacklow NR，Hoggan MD，Kapikian AZ，et al. Epidemiology of adenovirus-associated virus infection in a nursery population.Am J Epidemiol，1968; 88: 368-378

　　17 Halbert CL，Standaert TA，Aitken ML，et al. Transduction by adeno-associated virus vectors in the rabbit airway: efficiency，persistence，and readministration.J Virol，1997; 71: 5932-5941

　　18 Snyder RO，Miao C，Meuse L，et al. Correction of hemophilia B in canine and murine models using recombinant adeno-associated viral vectors.Nat Med，1999; 5: 64-70

　　19 Snyder RO，Miao CH，Patijn GA，et al..Persistent and therapeutic concentrations of human factor Ⅸ in mice after hepatic gene transfer of recombinant AAV vectors.Nat Genet，1997;16: 270-276

　　20 Mandel RJ，Spratt SK，Snyder RO，et al..Midbrain injection of recombinant adeno-associated virus encoding rat glial cell line-derived neurotrophic factor protects nigral neurons in a progressive 6-hydroxydopamine-induced degeneration model of Parkinson′ s disease in rats.Proc Natl Acad Sci USA，1997; 94:14083-14088

　　21 Kaplitt MG，Leone P，Samulski RJ，et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.Nat Genet，1994; 8: 148-154

　　22 Herzog RW，Hagstrom JN，Kung SH， et al.Stable gene transfer and expression of human blood coagulation factor Ⅸ after intramuscular injection of recombinant adeno-associated virus.Proc Natl Acad Sci USA，1997; 94: 5804-5809

　　23 Herzog RW，Yang EY，Couto LB，et al.Long-term correction of canine hemophilia B by gene transfer of blood coagulation factor Ⅸ mediated by adeno-associated viral vector.Nat Med，1999; 5: 56-63

　　24 Snyder RO，Spratt SK，Lagarde C， et al. Efficient and stable adeno-associated virus-mediated transduction in the skeletal muscle of adult immunocompetent mice.Hum Gene Ther，1997; 8: 1891-1900

　　25 陈焱，陈方平，彭建强等.2型重组腺相关病毒对人脐血CD34+造血干/祖细胞的转导效率研究.中国实验血液学杂志，2003; 11：576-578

　　26 Sattil SJ，Cunningham M，Hoxie JA. Detection of activated platelet in whole blood using activation-dependent monoclonal antibodies and flow cytometry.Blood，1987; 70: 307-315

　　27 Taub R，Gould RL，Garsky VM，et al. A monoclonal antibody against the platelet fibrinogen receptor contains a sequence that minics a receptor recognition domain in fibrinogrn.J Bio Chem，1989; 264:259-265