急性白血病细胞与正常白细胞差异蛋白质组分析

　　作者：崔久嵬,王冠军,李薇,王杰　　作者单位：吉林大学第一医院血液肿瘤科，130021 长春; 1国家医学生物分析中心，100850 北京

　　【摘要】本研究利用蛋白质组学方法将急性白血病(acute leukemia，AL)细胞与正常白细胞进行差异蛋白质组分析，为AL的分子诊断和白血病发生的分子机制研究奠定基础。利用二维凝胶电泳将40例AL患者的AL细胞和20例正常自愿者淋巴细胞、粒细胞的蛋白质进行分离，利用MALDI-TOF-MS生物质谱和电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS) 对差异表达的蛋白质进行鉴定分析。结果表明： 在AL细胞与正常细胞的差异表达蛋白质中，一些与肿瘤的恶性转化(如Op18和NM23-H1)、细胞增殖(如PCNA)、抑制凋亡(如肿瘤坏死因子抑制蛋白)等相关的蛋白在AL细胞中高表达，而一些与正常白细胞分化和生理功能相关的蛋白质在AL细胞中低表达。结论： AL的发生涉及到众多的细胞事件，一些与恶性转化，细胞增殖和抑制凋亡等相关的蛋白在AL细胞中高表达，蛋白质组学分析为急性白血病发病的分子机理的解析提供了一个新的手段。

　　【关键词】 淋巴细胞

　　Abstract This study was aimed to analyze the different proteomes between human acute leukemia (AL) cells and normal white blood cells by proteomic technology in order to lay the basis for diagnosing AL and understanding the mechanism of leukemogenesis. The proteins from AL cells of 40 AL patients identified by FAB classification and proteins from normal lymphocytes and granulocytes of 20 normal volunteers were separated by two-dimensional electrophoresis (2-DE)，and the differentially expressed proteins between the two groups were identified by both matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry(MALDI-TOF-MS) and electronspray ionization(ESI)-MS/MS.The results showed that among the differentially expressed proteins between AL cells and normal lymphocytes and granulocytes，some proteins involved in the process of malignant transformation (such as Op18，NM23-H1)，cell proliferation (such as PCNA) and apoptosis inhibition (such as tumor necrosis factor inhibitor protein) were found to be up regulated in AL cells.However，some proteins involved in differentiation and physiological functions of normal cells were down regulated in AL cells.It is concluded that there are many events involved in the process of leukemogenesis，expression of some proteins relating to the malignant transformation，cell proliferation and apoptosis inhibition are up-regulated in AL cells. The proteome analysis may provide a new approach to explaining the molecular mechanism underlying the pathogenesis of AL.

　　Key words acute leukemia; lymphocyte; granulocyte

　　急性白血病(acute leukemia，AL)发生发展过程中涉及到众多基因和表型变化，为了实现对AL的准确诊断和特异性治疗，研究者们一直致力于AL的分子特征的研究。蛋白质组学技术是以整体蛋白质作为研究对象，它为寻找AL的分子特征提供了一个全新的手段。本研究将AL细胞与正常淋巴细胞和中性粒细胞蛋白质组特征进行比较分析，以了解白血病发病机制和其生物学特征的分子基础。

　　材料和方法

　　主要试剂和仪器

　　硝酸银、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、碘乙酰胺、过硫酸胺(APS)、TEMED均为Sigma公司产品、IPG干胶条(ImmobilineTM DryStrip，pH3-10，18 cm)、IPG缓冲液(IPG buffer，pH 3-10)购于Amersham Pharmacia，三氟乙酸购自Fluka公司，乙腈购自Fisher公司，经修饰的测序级胰酶、蛋白酶抑制剂的混合片(cocktail tablets)购自Roche诊断公司。固相pH梯度等电聚焦仪(IPGphor IEF System)为Amersham Pharmacia公司产品。垂直板蛋白电泳仪(PROTEAN Ⅱxi Cell)为Bio-Rad公司产品。凝胶图像扫描仪(ImageScanner)为Amersham Pharmacia公司产品。MALDI-TOF-MS为Bruker公司的Reflex III型质谱仪，加速电压为20 kV，为反射式正离子检测方式。电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)为英国Micromass公司的正交加速电喷雾串联质谱仪Q-TOF2，配备有毛细管液相色谱和纳升喷雾源，所有测定均在正离子模式下进行。

　　标本来源

　　标本来源于吉林大学第一医院血液肿瘤科40例依FAB分型方案初诊为AL、未经化疗的患者的骨髓细胞(5例M1型，3例M2型，5例M3型，6例M4型和6例M5型AL患者，15例急性淋巴细胞白血病患者)，年龄17-60 岁(中位年龄42 岁)。正常标本为20例健康志愿者外周血单个核细胞。

　　样品制备

　　利用淋巴细胞分离液(相对密度1.077)梯度离心分离白血病患者骨髓细胞，取单个核细胞层，即为AL细胞。抽取健康自愿者抗凝外周血20 ml，Percoll梯度离心(具体操作见产品说明书，Amersham Pharmacia)，产生3条细胞带，其中最上层的带1为淋巴细胞、带2为中性粒细胞。显微镜下计数和观察细胞形态(仅选用白血病细胞占骨髓单个核细胞90%以上的标本和正常淋巴细胞和粒细胞占90%以上的标本进行后续分析)。每5×107个细胞加裂解液500 μl(8 mol/L尿素，4% CHAPS，40 mmol/L Tris base，1×混合蛋白酶抑制剂)，混匀后用液氮反复冻融2次。再加入20 μg/ml DNase I和5 μg/ml RNase A，冰浴20分钟，4℃，10 000×g，离心30分钟，取上清，Bradford法定量后将蛋白分装，-70℃保存备用。

　　双向凝胶电泳

　　用双向凝胶电泳(2-DE)[1]方法进行细胞蛋白质的分离，利用银染[2]和考马斯亮蓝染色方法进行电泳凝胶染色。

　　凝胶图像采集与分析

　　染色后的双向电泳凝胶用凝胶图象扫描仪(Amersham Pharmacia Biotech)扫描。数字化图像文件采用Nonlinear Dynamics公司的二维电泳处理软件(ImageMasterTM 2D Elite 3.01)分析，获得每个蛋白点的分子量(Mr)、等电点(pI)及相对含量。Table. Differentially expressed proteins between AL and normal white blood cells identified by MALDI-TOF-MS

　　差异表达蛋白点的质谱鉴定

　　在建立差异蛋白质表达谱之后，我们加大双向电泳中的蛋白上样量(0.5-1 mg)，用考马斯亮蓝染色方法进行染色，找到对应的差异点，切出蛋白点后进行脱色，胶内胰酶酶切和肽段提取[3]，然后用MALDI-TOF/MS进行肽质量指纹谱(PMF)分析[4]。进一步用电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)[5]对部分肽段测序后进行检索以确定MALDI-TOF/MS分析结果。检索结果的可靠性用肽段匹配率、得分值(score)和匹配肽段在对应蛋白内的序列覆盖率进行评价。

　　差异点的标示

　　鉴定出来的差异蛋白点标示在相应的分析胶上(银染2-DE图)，在AL细胞与正常白细胞差异表达的蛋白点标记为N。各差异点的顺序号为本工作发现的先后顺序。

　　统计学分析

　　用Newman-Keuls方法检验差异蛋白点相对含量的差别是否有统计学意义。

　　结 果

　　2-DE图谱的分析

　　本研究的AL患者的骨髓标本经密度梯度离心，白血病细胞占单个核细胞的90%以上，正常淋巴细胞和中性粒细胞占90%以上。经ImageMaster 2-D Elite 3.0软件及手工分析，每块2-DE胶可分离近1 400左右个蛋白点，同一份标本平行电泳的匹配率在95%以上，并且各蛋白点的强度变化无显著性差异。图1A-B所示分别为正常淋巴细胞的2-DE图谱(图1A所标识的蛋白点为AL细胞与正常淋巴细胞和中性粒细胞相比，在AL细胞中低表达的部分蛋白点)和ALL细胞2-DE图谱(图1B所标识的蛋白点为在AL细胞中与正常淋巴细胞和中性粒细胞相比高表达的部分蛋白点)，图1C-D为相应差异点在2-DE图谱上的局部放大图。

　　差异表达点的质谱鉴定

　　在建立各型AL细胞2-DE图谱后，将在AL各型中均存在的区别于正常白细胞的蛋白点定义为差异表达点，我们加大双向电泳中的蛋白上样量(1 mg)，用考马斯亮蓝染色方法进行染色，找到对应的差异点，切出蛋白点后进行脱色、胶内胰酶酶切和肽段提取，然后用MALDI-TOF/MS进行肽质量指纹谱(PMF)分析;进一步用电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)对部分肽段测序后进行检索。鉴定结果表明，大多数蛋白点的出峰情况较好，用电喷雾串联质谱测出部分肽段序列进行数据库查询的结果进一步证实了PMF检索得到的结果。本研究蛋白点质谱鉴定的详细列表见附表。其中实验等电点和分子量是根据蛋白点在双向电泳胶上的位置，用图像分析软件分析后得到。图2A-B为ESI-MS/MS对N-11蛋白点进行鉴定的PMF和序列分析的结果。

　　AL和正常白细胞的差异表达蛋白

　　AL和正常白细胞的差异表达蛋白，是各型AL细胞都表现出与正常白细胞有差异的点，并不包括在AL各亚型中特异表达点。对41个AL和正常白细胞间的差异表达蛋白点进行了鉴定，结果显示41个差异表达的蛋白点对应31个不同蛋白，具体鉴定结果如附表所示。其中在AL细胞中高表达的蛋白，如NM23-H1、癌蛋白18(oncoprotein 18，OP18)，(如图1C所示，其蛋白点的强度为正常白细胞的8-12倍)、增殖细胞核抗原(PCNA)(如图1C所示，其蛋白点的强度为正常白细胞的12-20倍)、细胞凋亡抑制因子(其蛋白点的强度为正常白细胞的6-8倍)、肿瘤坏死因子抑制蛋白(tumor necrosis factor inhibitor protein，TIP)(如图1D所示，其蛋白点的强度为正常白细胞的6-8倍)。与正常粒细胞和淋巴细胞相比，调节性肌动蛋白轻链-2(MLC-2)、调节性肌动蛋白轻链-3(MLC-3)(正常白细胞其蛋白点的强度为AL细胞的8-11倍)和髓系相关蛋白-8 (Mrp8) 和Mrp 14 (正常白细胞的其蛋白点的强度为AL细胞的14-20倍)在AL细胞中低表达。

　　讨 论

　　蛋白质是生理、病理过程的直接执行者，不同的疾病过程、不同的治疗反应、不同的预后必然由蛋白质或蛋白质间相互关系的改变所导致，当mRNA丰度与蛋白质含量不成正相关或牵涉到蛋白质修饰等问题时，直接对白血病细胞蛋白质进行研究无疑是揭示细胞生命本质特征的更重要方案。以前对AL细胞蛋白质分子特点的研究取得了一定进展，但主要集中在对个别或少数蛋白质的作用进行探讨，而白血病发生涉及了众多的细胞事件，因此有必要用更高通量的方法，全面地分析AL细胞的蛋白质表达特点。

　　本研究应用2-DE和质谱技术等蛋白质组学研究方法对AL 和正常白细胞蛋白质组特征进行分析，以寻找二者蛋白质差异表达谱。虽然将白血病细胞与其分化同阶段的相应的正常细胞相比较更有利于找到与AL发生相关的关键蛋白质，但由于目前技术的限制很难获得分化为同一阶段的纯度(90%)较高的正常白细胞。本研究将AL细胞(由于M6、M7型AL少见，不包括在本研究中)和相应正常的成熟淋巴细胞和中性粒细胞蛋白质组进行比较分析(其差异蛋白涉及到分化相关蛋白和白血病发生相关的蛋白)，对AL诊断和发病机制研究具有重要的临床意义。

　　在AL和正常白细胞差异表达的蛋白中，有一些与肿瘤的恶性转化和细胞异常增殖有关的蛋白在AL细胞中高表达。例如，OP18(oncoprotein 18)在细胞生长调节通路调控中起重要作用，利用反义核苷酸技术阻止OP18的表达，可使细胞增殖能力下降[6]。本研究显示OP18是各型AL细胞胞浆的主要组成成份。PCNA在调节DNA复制与细胞增殖过程中起重要作用，其表达强度可以反映细胞增殖活性 [7]和肿瘤细胞的生长速度，PCNA 在AL细胞中较正常细胞中明显高表达(N-1点)，提示AL细胞较正常细胞具有高的增殖特性。TNF可使细胞发生坏死和凋亡，而TIP能够使细胞免于由TNF所诱导的凋亡[8]，本实验显示TIP在AL中表达明显高于正常细胞(N-8点)，提示其与AL细胞的免疫逃逸有关。在实体瘤NM23(N-11点)蛋白具有抑制肿瘤转移的作用，而在造血系统，NM23在低分化的细胞中表达量高于相对分化细胞，本实验显示在AL细胞中较正常细胞高表达，与文献报道一致[9]。

　　一些蛋白在2-DE上的位置与理论pI和Mr不符，或在2-D胶上表现出不同的蛋白点经鉴定为同一蛋白质，这与蛋白质的翻译后修饰有关，如蛋白酶降解、糖基化和磷酸化。

　　我们应用蛋白质组学的方法对AL细胞和正常白细胞进行了差异蛋白质组的研究，研究显示AL细胞蛋白质表达谱与其临床表现及其形态特点呈现明显的相关性，虽然要获得更全面的AL蛋白质表达特征，需要大量的工作，但本研究结果表明，蛋白质组学方法为AL细胞分子特征的研究提供了一种新的有效研究手段，通过本研究的扩展有助于发现与白血病发生及进展相关分子机制。

　　【参考文献】

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