5负载U266细胞抗原的树突状细胞诱导T细胞的抗骨髓瘤活性

　　作者：丁岩松,陈文明　　作者单位：首都医科大学附属北京朝阳医院血液内科，北京，100020

　　【摘要】本研究探讨负载骨髓瘤U266细胞裂解物的树突状细胞(DC)瘤苗活化的T细胞对U266细胞的体外杀伤作用。用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，然后分别用含重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、重组人白细胞介素4(IL4)的AIMV无血清培养液和含胎牛血清的RPMI 1640培养液体外诱导培养DC，用MTT法检测负载U266细胞全抗原的DC活化的T细胞对U266细胞的杀伤作用。结果表明：健康人外周血来源的单个核细胞用无血清培养液和含血清培养液诱导培养均可得到足够数量的DC，这两种培养液培养的DC在表型上无明显差异。分别用负载U266细胞全抗原的DC+IL2、成熟DC+IL2和单独应用IL2刺激后的T细胞与U266细胞共培养，其对U266细胞的杀伤作用逐渐减弱，负载U266细胞全抗原的DC+IL2刺激后的T细胞较成熟DC+IL2刺激后的T细胞对U266细胞的杀伤作用明显，且T细胞对U266细胞的杀伤率随效靶比的增加而升高。结论：用GMCSF、IL4诱导培养健康人外周血单个核细胞可以得到不成熟的DC，体外负载U266细胞全抗原的DC可以刺激自体T细胞增殖并能杀伤U266细胞。

　　【关键词】 多发性骨髓瘤,树突状细胞,免疫治疗

　　Abstract This study was aimed to investigate the effect of T cells activated by DCs loaded with whole antigens of U266 cells on the U266 cells survival in vitro. Peripheral blood mononuclear cells were isolated from healthy donor, and adherented on culture plate. Adherent cells were cultured in AIMV serumfree medium or in RPMI 1640 medium contained 20% fetal bovine serum (FBS), supplemented with granulocytemacrophage colony stimulating factor (GMCSF) and interleukin4 (IL4). Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay was used to evaluate killing rate of U266 cells by T cells activated by DCs loaded with whole antigen of U266 cells. The results showed that DCs derived from peripheral blood mononuclear cells cultured by AIMV serumfree medium or RPMI 1640 medium containing FBS had similar immunophenotype. T cells activated by DCs loaded with whole antigen of U266 cells or mature DCs might kill U266 cells in a dosedependent manner. It is concluded, DCs derived from peripheral blood mononuclear cells of healthy donor and loaded with whole antigen of U266 cells can induce antimyeloma response of T cells in vitro.

　　Key words multiple myeloma; dendritic cell; immunotherapy

　　J Exp Hematol 2007; 15(3):581-585

　　树突状细胞(DC)是体内功能最强的抗原呈递细胞(APC)，存在于除脑组织外的所有组织器官中，是机体免疫反应的始动者，其表达丰富而独特的免疫球蛋白分子而发挥免疫佐剂的作用。DC表面的免疫球蛋白不仅可以聚集免疫细胞，而且有利于免疫细胞间的信息传递;DC受抗原性物质刺激后能够分泌多种细胞因子，诱导特异性的免疫反应。肿瘤免疫逃避的机制之一是抗原呈递细胞的数量不足或功能下降，而肿瘤细胞的清除要依靠宿主抗原呈递细胞的强有力的功能。DC作为最强的唯一能激活初始T细胞的抗原呈递细胞，在治疗肿瘤和预防肿瘤发生、复发及转移中发挥重要作用。

　　目前针对多发性骨髓瘤的治疗主要采用化疗和造血干细胞移植等综合治疗，取得了一定的效果，但微小残留病灶的存在使骨髓瘤易复发，患者生存期缩短。以DC为基础的免疫治疗是近几年来清除骨髓瘤微小残留病研究的热点。国外报道用无血清培养液诱导培养骨髓或外周血单个核细胞来源的DC，然后用凋亡的骨髓瘤细胞或骨髓瘤细胞分泌的单克隆免疫球蛋白(Ig)，即M蛋白负载DC，使其捕获、加工并表达肿瘤抗原而得到DC瘤苗，再通过静脉或皮下注射的方式回输体内，可以观察到骨髓瘤特异的抗瘤效应[1，2]。国内这方面的研究较少。本实验体外诱导培养健康人外周血来源的DC，使其负载骨髓瘤细胞系U266细胞全抗原，探讨负载抗原的DC对淋巴细胞的活化作用，及活化的淋巴细胞对U266细胞的杀伤活性。

　　主要试剂

　　U266细胞系来自本试验室，AIMV无血清培养液、RPMI 1640细胞培养液、胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司;淋巴细胞分离液(1.077 g/ml)、MTT购自Sigma公司;重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGMGSF)、重组人白细胞介素4(rhIL4)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素2(IL2)均购自Sigma公司;荧光标记的鼠抗人单克隆抗体CD1αFITC，CD14FITC，CD80FITC，CD86PE，CD83FITC，HLADRPE均购于美国Becton Dickinson公司。

　　DC的培养、收集及鉴定

　　参照Wen等[3]诱导培养外周血来源DCs的方法并加以改进。取10例健康人抗凝外周血40 ml，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMNC);用RPMI 1640洗涤并重悬PBMNC，调整细胞浓度为2×106/ml，加于6孔培养板中，每孔2 ml，放置于37℃、5% CO2，相对湿度95%培养箱中孵育2小时后，收集非贴壁细胞(淋巴细胞)作为效应细胞。取少量细胞，用流式细胞仪检测T细胞含量，其余细胞冻存。贴壁细胞继续培养,分别加入AIMV无血清培养液和含20% FBS的RPMI 1640培养液，两种培养液中均加入rhGMCSF 100 ng/ml、rhIL4 50 ng/ml，放置于37℃、5% CO2培养箱中孵育，每3天半量换液并补充细胞因子，6天后收集悬浮和吹吸下来的轻微黏附细胞即为不成熟DC。取部分细胞做细胞表型检测，在部分细胞培养孔中加入TNFα 10 ng/ml诱导DC成熟，继续培养48小时后收集细胞做表型检测。

　　U266细胞全抗原的制备

　　将-80℃保存的U266细胞解冻后传代培养，取增殖旺盛的细胞用于实验。将细胞(5×105/ml)在液氮中反复冻融6次，此时经台盼蓝染色后显微镜观察细胞裂解率可达99%，然后600×g离心10分钟，上清液经孔径0.22 μm的滤过膜除菌后即为U266细胞裂解物，此裂解物含有U266细胞的全抗原。

　　U266细胞裂解液致敏对DC的致敏

　　DC培养至第6天，部分培养孔中加入100 μl U266细胞裂解液和TNFα 10 ng/ml，放置于37℃、5%、相对湿度95%、CO2培养箱中孵育，使DC负载U266细胞全抗原。48小时后用PBS轻轻冲洗，收集悬浮细胞，即为U266细胞裂解液致敏的DC。

　　效应细胞的增殖

　　复苏冻存的效应细胞(淋巴细胞)，用台盼蓝染色判断细胞活性，活细胞拒染，用RPMI 1640培养液调整效应细胞浓度为2×106/ml，置于96孔板中，50 μl/well，按照不同的刺激物分为3组，每组设3个复孔。参考文献[4]，第1组加入IL2(30 ng/ml);第2组加入IL2(30 ng/ml)和U266细胞裂解液致敏的DC(2×105/ml)，第3组加入IL2(30 ng/ml)和成熟DC(2×105/ml)，放置于37℃、5%、相对湿度95%、CO2培养箱中培养5天后，收集细胞并计数，以此细胞作为活化的效应细胞。

　　T细胞杀伤活性测定

　　以U266细胞为靶细胞，传代培养，取生长旺盛的细胞用于实验。按照5∶1、10∶1、20∶1的效靶比(E∶T)，在效应细胞(终浓度为2×106/ml，50 μl/well)孔内分别加入相应量的靶细胞。另设置靶细胞(细胞数同效应细胞孔)和效应细胞对照孔，每孔设3个复孔，所有孔的液体总量相同，不足的以RPMI 1640培养液调整，于37℃、5% CO2培养箱中孵育4-6小时，加入MTT溶液10 μl/well，继续培养4小时。加入MTT助溶剂DMSO 100 μl/well，充分溶解，静置5分钟。酶标仪以波长490 nm测OD值，以3孔均数值表示。按公式计算T淋巴细胞杀伤率。

　　杀伤率(%)=[靶对照组OD-(效靶组OD-效应

　　对照组OD)/靶对照组OD]×100%。

　　统计学方法

　　实验数据以(±SD)表示，应用SPSS 11.5统计学软件处理，P<0.05为有统计学意义。

　　结 果

　　树突状细胞的表型分析

　　健康人外周血单个核细胞在含有rhGMCSF、rhIL4的AIMV无血清培养液和含有20% FBS的RPMI 1640培养液中培养，第3天均可以观察到部分细胞悬浮生长，并形成集落，呈圆形或类圆形，可见毛刺状突起，但大部分细胞仍贴壁生长，细胞周边有不规则突起;6天后加入TNFα，有更多的细胞悬浮生长。流式细胞仪分析两组培养液培养的DC表型，未加入TNFα之前,DC表达CD1α、CD80、CD86、HLADR，不表达CD14、CD83，符合不成熟DC(imDC)的特点，并且两组培养液培养的imDC在细胞免疫表型表达上无明显统计学差异(P>0.05)。

　　加入TNFα 48小时后，流式细胞仪分析两组培养液培养的DC表型，结果DC表达CD1α、CD80、CD86、CD83，不表达CD14、HLADR(表2)，符合成熟DC(mDCs)的特点，并且两组培养液培养的成熟DC在细胞免疫表型表达上无明显统计学差异(P>0.05)。

　　T细胞的杀伤活性

　　以非贴壁细胞(淋巴细胞)作为效应细胞，流式细胞仪检测T细胞比例约为24%。T细胞杀伤活性测定中，效应细胞分别为IL2活化的T细胞和IL2+U266细胞全抗原致敏DC活化的T细胞，IL2+未经U266细胞全抗原致敏DC活化的T细胞，按照5∶1、10∶1、20∶1的比例与U266细胞(靶细胞)混合培养，MTT法测定OD值,根据公式计算1、2、3各组不同效靶比时T细胞对U266细胞的平均杀伤率，结果见表3。从表3中可以看出，与IL2活化的T细胞(第1组)相比，IL2+U266DC活化的T细胞(第2组)和IL2+成熟DC活化的T细胞(第3组)对U266细胞的杀伤作用更明显(P=0.000)，并且杀伤率随着效靶比的增大而增大，E∶T=20∶1时T细胞对U266细胞的杀伤作用最大;与IL2+成熟DC活化的T细胞(第3组)相比，IL2+U266DC活化的T细胞(第2组)对U266细胞的杀伤作用更明显(P=0.000)。

　　讨 论

　　DC是已知功能最强的抗原呈递细胞(APC)，存在于除脑组织外的所有组织器官中，与B细胞、巨噬细胞、活化的T淋巴细胞等其它APC不同的是，DC是唯一能刺激初始T淋巴细胞增殖的APC，是机体免疫反应的始动者。树突状细胞受抗原性物质刺激后能够分泌多种细胞因子，诱导特异的免疫反应。对于外源性抗原如细菌、真菌和胞外寄生虫等，DC通过MHCⅡ类分子途径激活初始CD4+T细胞。对于内源性抗原如病毒包膜蛋白、胞内寄生菌等在DC细胞中内源合成的蛋白质，是通过MHCⅠ类分子途径被CD8+T细胞的TCR识别，刺激产生CTL。DC还能通过自身分泌或诱导其它细胞分泌IL12而启动CD4+相关免疫应答，活化的Th细胞可通过产生IFNγ、GMCSF和TNFα等细胞因子正反馈上调DC分泌IL12和共刺激分子。DC也能直接向CD8+ CTL呈递抗原，CD4+和CD8+T细胞通过共同分泌细胞因子或直接杀伤肿瘤细胞而产生抗肿瘤反应。另外，DC还通过表达高水平的多种共刺激分子(如B71/CD80、B72/ CD86和CD40)和黏附分子(如ICAM1/CD54、LFA3/CD58)使T细胞充分激活，产生抗肿瘤反应。

　　DC在体内的数量极少，占人外周血单个核细胞的1%以下，直接获取大量DC较难，因此有必要寻找有效途径进行体外扩增。目前，体外扩增用的DC主要来源有：骨髓CD34+干细胞、外周血CD14+单核细胞和脐血CD34+干细胞。骨髓取材较困难，对患者有一定创伤;脐血尽管来源丰富，但脐血来源的DC存在MHC限制性，限制了临床应用;外周血来源的DC由于采集简便、患者痛苦小，已广泛应用于临床。适当的细胞因子配伍和应用顺序对DC的诱导培养影响很大。常用的细胞因子为GMCSF、IL4和TNFα。GMCSF可以调控CD34+细胞向粒系分化并产生CFUDC,是维持DC分化发育最基本的细胞因子。IL4可以抑制其向巨噬细胞分化的潜能，并维持DC于未成熟状态，从而使其具有较强的负载并提呈抗原的潜能。TNFα可以促使DC成熟。除此之外，SCF、Flt、IL3、IL1β等都具有提高DC数量的作用。DC的CD40分子配基(CD40L)能强有力地促进DC的增殖和成熟。本研究参照文献[3]在体外用细胞因子rhGMCSF、rhIL4诱导扩增外周血来源的DC前体细胞定向分化为DC并扩增，研究表明40ml外周血可收获(1-3)×106的DC。

　　Feuerstein等[5]就体外扩增的大量DC如何保存进行了研究，结果发现以自体血浆+10% DMSO+5%葡萄糖组成的配方可有效的保存疫苗于液氮中至少4个月，复苏后细胞活力达85%-100%，冻存的DC的表型及功能与新鲜的DC无显著性差异。还有人用40%人AB血清和20% DMSO来保存DC[6]。国内有学者采用聚四氟乙烯袋内培养DC，用10% DMSO+20%人血白蛋白保存DC疫苗于-80℃或液氮中，1个月后复苏DC细胞活力达70%左右，其表型及功能未受明显影响[7]。表明体外扩增后的DC经复苏后大部分仍有活性。

　　目前国内培养DC多采用RPMI 1640+FBS培养液，应用此种含血清的培养液培养的DC在应用于临床时，由于含有异种血清，重复接种有可能诱发异种免疫反应，造成不良后果，并且FBS含有大量的细胞因子和活性成分，容易使培养的DC质量不易控制。使用AIMV无血清培养液则避免了上述问题，使体外培养的DC能够安全的应用于临床。

　　Reichardt等[2]选取12例大剂量化疗或干细胞移植后3-6个月的多发性骨髓瘤患者的外周血单核细胞，分别在无血清和血清条件下诱导培养DC，发现二者在诱导特异性T细胞增殖反应中的作用是相同的。用无血清培养的DC负载Id，以匙孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)为佐剂，10例患者中有2例出现了Id特异性的T细胞增殖，1例出现了Id特异性细胞毒性T细胞反应。本研究采用AIMV无血清培养液培养健康人外周血来源的DC，与含FBS的培养液相比，培养出的DC在数量、表型和刺激T细胞增殖上无显著性差异，这为DC的临床应用打下基础。体外分离肿瘤抗原脉冲DC，使其致敏得到DC瘤苗，该瘤苗进入体内不仅保证肿瘤抗原被有效摄取、呈递，还可提供攻击肿瘤细胞必需的共刺激分子，能够结合并杀伤肿瘤细胞。

　　体外负载肿瘤抗原的方式很多，由于特异性的肿瘤抗原易产生免疫耐受或免疫逃避，目前多采取以下几种方法使DC负载肿瘤抗原：①肿瘤细胞与DC融合：将肿瘤细胞与DC通过化学方法(聚乙二醇法)或物理方法(电融合)进行融合,可以使DC负载所有的肿瘤抗原信息;同时融合细胞又保留了DC的MHC分子和共刺激分子等表面标志。肿瘤DC融合细胞不但具有DC的抗原呈递功能,还能表达内源性肿瘤抗原以进入MHCⅠ类分子的呈递途径。②肿瘤细胞裂解物负载DC：通过反复冻融法、超声法破碎肿瘤细胞，离心过滤获取肿瘤细胞的裂解上清液，加入DC培养液中，可诱导Id特异性的CTL作用。③凋亡肿瘤细胞负载DC：未成熟DC可以吞噬凋亡体并摄取加工和提呈肿瘤抗原。多种配体和受体分子参与了DC对凋亡体的识别和摄取，其中较为重要的是整合素αvβ和CD36[8]。通过紫外线或γ射线照射、流感病毒感染以及放线菌素D、丝裂霉素C、神经酰胺等处理可诱导肿瘤细胞凋亡。④肿瘤细胞基因转导DC：肿瘤细胞RNA包含编码肿瘤细胞全部抗原，可以利用肿瘤细胞的RNA转染DC从而诱导肿瘤特异性CTL效应。本研究采用了较简便的肿瘤细胞裂解物即骨髓瘤细胞全抗原来负载DC，通过液氮反复冻融法制备U266细胞裂解物，台盼蓝染色后显微镜观察细胞裂解率可达到99%以上。负载健康人外周血来源的DC后与T细胞共培养，最后将T细胞与U266细胞按照效应细胞:靶细胞5∶1、10∶1、20∶1共同培养，MTT法检测T细胞对U266细胞的杀伤比率，结果表明T细胞杀伤率随着效靶比的增加而增加;未负载U266细胞全抗原的DC活化的T细胞对U266细胞也有杀伤作用，但较负载U266细胞全抗原的DC活化的T细胞对U266细胞杀伤作用小，可能与非特异性细胞毒作用有关。

　　总之，用健康人外周血诱导扩增DC，体外负载U266细胞全抗原后可以刺激自体T细胞增殖并能特异性杀伤U266细胞。因此，体外培养外周血来源的DC负载瘤细胞全抗原后有望应用于临床以清除微小残留病。

　　【参考文献】

　　1Fields RC, Shimizu K, Mule JJ. Murine dentritic cells pulsed with whole tumor lysates mediates potent antitumor immune responses in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 1998; 95: 9482-9487

　　2Reichardt VL, Milazzo C, Brugger W, et al. Idiotype vaccination of multiple myeloma patients using monocytederived dendritic cells. Haematologica, 2003; 88: 1139-1149

　　3Wen YJ, Min R, Tricot G, et al. Tumor lysatespecific cytotoxic T lymphocytes in multiple myeloma: promising effector cells for immunotherapy. Blood, 2002; 99: 3280-3285

　　4Raje N, Hideshima T, Davies FE, et al. Tumour cell/dendritic cell fusions as a vaccination strategy for multiple myeloma. Br J Haematol, 2004; 125: 343-352

　　5Feuerstein B, Berger TG, Maczek C, et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen preloaded, mature dendritic cells ready for clinic use. J Immunol Medthod, 2000; 245: 15-29

　　6Pecher G, Schirrmann T, Kaiser L, et al. Efficient cryopreservation of dendritic cells transfected with cDNA of a tumour antigen for clinical application. Biotechnol Appl Biochem, 2001; 34: 161-166

　　7曹华, Verg V, Martinache C, et al. 从单核细胞分化的树突状细胞的低温保存及其临床应用. 中国实验血液学杂志, 2000; 8: 245-250

　　8Fonteneau JF, Larsson M , Bhardwaj N , et al. Interactions between dead cells and dendritic cells in induction of antiviral CTL responses. Curr Opin Immunol, 2002; 14: 471-477