D二聚体两种定量检测方法的评价

　　作者：夏汛生　　作者单位：华中科技大学同济医学院同济医院检验科，武汉 430030

　　Abstract: Objective To evaluate and compare the two quantitative analytical methods, flowthrough immunoassay and turbidmetric immunoassay.Methods We performed repeatability, stability, linearity, antiinterference tests and comparison study on the two methods, respectively.Results The turbidmetric immunoassay’s repeatability and stability were better than flowthrough immunoassay. The extent of influence of low to middle grade of jaundice, fat and hemolysis on the two methods were all less than 6%, but middle to high grade of fat will influence the flowthrough immunoassay seriously; in the comparison study, relativity of the two methods was not identical.Conclusion Both of the flowthrough immunoassay and turbidmetric immunoassay have good repeatability, stability, linearity, capability of antiinterference. But the results of comparison are not identical. Each method has unique virtue, the laboratary may select the fit one according to own demand.Key words: Ddimer; Method evaluation

　　D二聚体(Ddimer，DD)是纤溶酶水解交联纤维蛋白后形成的特异性降解产物，是体内高凝状态和继发纤溶亢进的分子标志物之一。近年来，定量检测DD含量已成为排查深静脉血栓(DVT)、肺栓塞(PE)、弥散性血管内凝血(DIC)等血栓性疾病的重要手段之一，并作为溶血栓治疗的动态监测指标[1]。目前对DD的主要定量检测方法为胶体金法(免疫渗滤法)和免疫比浊法。现根据临床和实验室标准协会(CLSI)相关文件，对两种定量检测方法进行评价与比较。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　1.1.1 免疫比浊法采用美国IL公司生产的ACL TOP全自动血凝仪及其配套DD检测试剂(批号：B50317);

　　1.1.2 胶体金法采用挪威AxisShield公司生产的Nycocard Reader 血浆DD检测光度计，及配套DD胶体金免疫渗滤试剂盒(批号：10122111)。

　　1.1.3 干扰物：胆红素标准品(上海科华公司生产，批号：GF 62 K)、脂肪乳(主要成分为甘油三酯，华瑞制药有限公司生产，批号：0510019)、血红蛋白(日本国际试药株式会社)。

　　1.2 标本

　　1.2.1 质控品：IL公司提供的正常及高值质控血浆;

　　1.2.2 血样：随机抽取住院病人及健康体检人群新鲜全血，用109 mmol/L枸橼酸钠抗凝， 3 000 r/min离心10 min，取得乏血小板血浆，3 h内完成检测。

　　1.3 方法

　　1.3.1 重复性实验(批内精密度)：根据CLSI的EP5A2文件[2]对于精密度评价的要求，分别采用免疫比浊法和胶体金法，在ACL TOP血凝仪与Nycocard Reader 光度计上测定正常及高值水平质控血浆DD含量。3 h内各水平连续测定20次，计算均值()、标准差(s)、变异系数(CV)。

　　1.3.2 稳定性实验(日间精密度) 按上述方法，分别测定正常及高值质控血浆DD含量，每天测定1次，连续测定20 d，计算、s、CV。

　　1.3.3 线性实验 根据CLSI [3]对线性评价的要求及免疫比浊法和胶体金法各自的线性范围，选取DD的高值和低值病人标本，低值标本为1号，高值标本为5号，二者3∶1混合为2号，等份混合为3号，1∶3混合为4号，制备成5个浓度梯度的样品，每个浓度样品重复检测4次，根据检测结果进行线性回归分析。

　　1.3.4 生物性物质干扰实验 根据CLSI EP7A文件[4]对干扰实验的相关要求，在体外向正常人混合血浆中加入不同浓度胆红素、脂肪乳、血红蛋白，加入的最高浓度参考临床标本可能出现的最高含量及试剂说明书的说明。分别使用免疫比浊法和胶体金法测定混合血浆，根据加入干扰物质前后的测定值计算影响度。

　　影响度=(加入后测定值-加入前测定值)/加入前测定值×100%。

　　1.3.5 比对实验 根据CLSI EP9A2文件[5]对能力比对的相关要求，选取随机的住院病人新鲜全血标本40例，采用上述两种方法平行检测DD含量，每天8例血浆，连续检测5 d。最后对检测结果进行相关性分析。

　　1.3.6 免疫比浊法与胶体金法DIC诊断效能的评价与比较：收集129例临床疑为DIC的患者标本，分别采用两种方法检测其FDP含量，以1999年全国DIC诊断标准修订方案作为确诊标准[6]，由此评价与比较两种方法的诊断效能，包括受试者工作特征曲线(Receiver operating Characteristic Curve，ROC)、敏感度、特异度等。

　　1.4 统计学方法 线性评价中根据理论值与实测值做相关曲线及回归方程，获得相关系数、截距、斜率等参数;DIC诊断效能评价中采用四格表计算敏感度、特异度。以上处理及ROC绘制均使用SPSS 11.0软件分析。

　　2 结 果

　　2.1 重复性与稳定性 比浊法和胶体金法的重复性与稳定性实验结果见表1。可见免疫比浊法重复性与稳定性要优于胶体金法。表1 ： DD批内及日间精密度测定结果DD

　　2.2 抗生物物质干扰 血浆的血红蛋白、三酰甘油、胆红素含量分别为0 g/L、80 mg/dl、1 mg/dl，加入不同浓度干扰物检测结果见表2。脂肪乳中三酰甘油含量由AEROSET生化分析仪(雅培公司，美国)测定。结果表明，血红蛋白达50 mg/dl、胆红素达5 mg/dl对胶体金法检测DD无影响，但在三酰甘油达450 mg/dl以上(中到高度脂血)时无法正确完成检测;血红蛋白达50 mg/dl、三酰甘油达900 mg/dl、胆红素达5 mg/dl对免疫比浊法检测DD影响度均<6%。

　　2.3 线性实验 各自试剂说明书，免疫比浊法检测DD线性范围为200~1 050 ng/ml，选取的高低值标本测得DD含量分别为975 ng/ml、175 ng/ml，计算得回归方程为y = 0.974x+5.296，相关系数(r)为0.997;胶体金法理论检测范围为100~20 000 ng/ml，选取的高低值标本测得DD含量分别为8 000 ng/ml、300 ng/ml，计算得回归方程为y=0.989x+118.68，相关系数(r)为0.994。结果表明胶体金法至少在300~8 000 ng/ml范围内仍能保持较好的线性;免疫比浊法线性范围较小，但可通过自动稀释样品检测高浓度DD。表2 生物干扰物对DD检测的影响干扰物

　　2.4 比对实验 将检测结果作回归曲线，得到免疫比浊法与胶体金法比对结果的回归方程：y = 0.3085x + 748.06，相关系数r=0.938。根据CLSI文件要求(r>0.975)，可见两种方法相关性不理想。

　　2.5 两种方法的DIC诊断效能 129例患者最终确诊为DIC的30例，非DIC 99例。两种方法诊断DIC的ROC见图1。曲线下面积分别为0.893(95%可信区间0.836~0.950)，0.899 (95%可信区间0.841~0.956);以DD含量500 ng/ml为诊断阈值，免疫比浊法的诊断敏感度与特异度分别为100%、42.6%，胶体金法分别为96.7%、46.1%。

　　3 讨 论

　　临床对深静脉血栓(DVT)、肺栓塞(PE)等的早期排查，及对溶血栓治疗的动态监测均需要一种对DD快速、准确的定量检测方法。目前胶体金法与免疫比浊法作为DD定量检测方法，得到越来越多的应用。胶体金法检测DD的原理为：加入的样品中DD分子被包被有DD特异性单克隆抗体的滤过膜吸附，随后加入DD单克隆抗体与胶体金的偶联物溶液，膜上的DD与抗体金偶联物发生三明治型结合反应，并产生颜色变化，此时通过光度计检测读数，颜色的强度与样品中DD含量成正比。免疫比浊法检测DD的原理为：样品中DD分子与包被有高特异性DD单克隆抗体的乳胶颗粒结合后，乳胶颗粒发生凝集，此时在405 nm波长下检测透射光强度变化，凝集程度与样品中DD含量成正比。两者均为免疫学方法，保证了较高的检测特异度。根据上述实验结果，两种定量检测方法均有准确、快速、简便的特点，尤其免疫比浊法通常由自动化仪器完成检测，具有更高的检测灵敏度与精密度，避免了人工加样的偶然误差;而胶体金法对设备要求较低，且相对免疫比浊法有更宽的线性范围。两种方法对DIC均有极高的诊断灵敏度，特异度稍低，适用于对DIC的联合诊断及排查。比对实验结果表明，两种方法相关性不理想，因此不建议一个实验室同时使用这两种方法报告DD检测结果，选择哪一种DD检测方法需各实验室根据自身具体情况决定。

　　【参考文献】

　　[1] 郭雪梅,王鸿利.快速D二聚体检测在诊断静脉血栓形成中的应用进展[J].中国实验诊断学,2000,4(1):4143.

　　[2] NCCLS.Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods; Approved Guideline–Second Edition. NCCLS document EP5A2 [ISBN 1562385429]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 190871898 USA, 2004.

　　[3] 杨国昌,许 叶. 线性评价和干扰实验中NCCLS评价方案的应用[J].临床检验杂志,1999,17:184185.

　　[4] NCCLS .Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guideline. NCCLS document EP7A[ISBN 1562384805]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 190871898 USA, 2002.

　　[5] NCCLS .Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved GuidelineSecond Edition. NCCLS document EP9A2 [ISBN 1562384724]. NCCLS, 940 West Valley Road,Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 190871898 USA, 2002.

　　[6] 刘泽霖. DIC的研究进展—诊断标准的探讨[J].血栓与止血学,2001,7(2):9396.