蛋白酶活化受体4 的研究进展

　　作者：王顺兰　　作者单位：汕头大学医学院变态反应学与炎症学研究所 广东汕头 515031

　　【关键词】 蛋白酶活化受体,胰蛋白酶,类胰蛋白酶; 血栓; 炎症

　　蛋白酶活化受体4(protease-activated receptor 4，PAR4) 是蛋白酶活化受体PARs (protease-activated receptors , PARs)的成员之一, PARs属于G蛋白偶联受体家族成员,其N-末端被蛋白酶裂解后,可形成新的N-末端，新N-末端能够结合、激活自身受体。PAR4激活、灭活、脱敏、复敏、及其与信号转导途径的关系,尤其是与疾病的关系正倍受关注，并且PAR4具有广泛的生物学效应,参与血液和呼吸道慢性炎症在内的诸多疾病的发生、发展过程, 因而受到日趋增多的关注。本文就PAR4发现以来的研究进展综述如下。

　　1 蛋白酶活化受体的结构和激活特点

　　PAR4 属于G 蛋白偶联受体家族成员的蛋白酶激活受体(protease-activated receptors , PARs)家族的成员，编码PAR4的人类基因和小鼠基因结构相似，其基因序列在1998年被克隆[1]。PAR4具有PARs共性：这类受体均由细胞外区(N-末端和细胞外袢)、跨膜区(7次跨膜螺旋)及细胞内区(细胞内袢和C-末端)组成。C-末端与受体脱敏(desensitation)和信号转导有关;N-末端有相应受体的蛋白酶裂解位点，细胞外袢2 则在PARs 激活中起关键作用。

　　PAR4具有PARs的激活特点：(1) PARs的激活依赖于蛋白酶对受体N-末端的裂解。蛋白酶识别相应PARs并裂解其N-末端的特殊部位并形成新的N-末端,即系锁配体(tethered ligand)。系锁配体与细胞外袢相互作用，自我激活PARs; (2) 配体是裂解受体的组成部分;(3) PARs的激活是不可逆的，即PARs 一旦被裂解，因其蛋白酶裂解部位丢失而不能够被再次裂解、激活。PARs 激活肽是系锁配体区关键氨基酸的合成肽，无蛋白酶活性，不能裂解PARs，但可直接与PARs 相应部位结合并激活PARs。活化的PARs引起信号级联反应，最终影响细胞的形态的改变、分泌蛋白和整合蛋白的活化、代谢反应、转录过程和细胞运动，由此参与细胞的信号转导作用。

　　2 PAR4的生物学性质

　　Kahn和Xu于1998年成功克隆了PAR4基因[1]，并从淋巴瘤Daudi细胞中得到了它的序列，全长为4.9 kb。它和PAR2的第4个跨膜区域有34%的同源性，由385个氨基酸组成，包含一个信号肽和1个N末端Arg/Gly丝氨酸蛋白酶结合位点，和其它3种PARs有33%的同源性，但是它的N末端和C末端的氨基酸序列和其它3种有明显的不同，它的2个外显子和其它3种相似。Northern blot显示PAR4的mRNA表达在人类的很多组织上，肺脏上高表达，胰脏，甲状腺，睾丸及小肠都有表达。荧光原位杂交实验显示人的PAR4基因位于19p12染色体。

　　当前，人工合成PAR4-激动肽(PAR4-AP)已经广泛应用于PAR4的各项研究，它们在体内具有相应配体功能。有试验运用多种人、大鼠和鼠科动物PAR4的系琐配体(tethered ligand)序列肽段 [2]，作为受体激活探针或者拮抗探针建立炎症模型以鉴定其生物学功能。在大鼠PAR4血小板凝集试验中，相关的激活序列[AYPGKF-NH(2)>GYPGKF-NH(2)>GYPGFK-NH(2)>GFPGKP-NH(2)]对PAR4的活性一致，颠倒或部分颠倒的序列肽段[VQGPYG-NH(2), YAPGKF-NH(2) 和 FKGPYA-NH(2)]是没有活性的，而trans-cinnamoyl (Tc)-YPGKF-NH(2), Tc-APGKF-NH(2) 和 N-palmitoyl-SGRRYGHALR-NH(2) (pepducin P4pal-10)起拮抗作用，但是这些拮抗肽在鼠大动脉舒张分析和胃纵肌收缩分析中则作为激动剂，其效价与其血小板聚集中的效价的顺序不同。因此PAR4系琐配体肽段激活剂在生物鉴定中可作为配体尤其是活体模型中可作为探针，能可靠反映PAR4活性。

　　3 PAR4介导的信号转导

　　PAR1 和PAR4协同调节人类血小板凝血酶信号，但两者作为受体介导的信号转导过程并不完全相同，从而发挥不同的作用。Shapiro等[3]报道PAR1和PAR4信号传导的速率不同，在转染的成纤维细胞中，PAR4较PAR1触发更多的磷酸肌醇生成，但其停止的速率和信号关闭较PAR1慢很多。PAR1触发细胞内快速瞬间升高Ca2+，而PAR4触发较为迟缓的反应，这些反应的速率解释了凝血酶触发的速率。因PAR1和PAR4在关闭方面的速率不同使得凝血酶触发的瞬间细胞内信号也不同。来自ADP分泌的组装刺激分泌信号对PAR4的活化作用比对PAR1更有效[4]， PAR4活化产生的迟发信号进一步增加了细胞内的Ca2+水平，支持晚期血小板的聚集过程。凝血酶在激活血小板过程中改变血小板形状，增加细胞内Ca2+浓度，激活αIIβ整连蛋白，促进释放分泌颗粒，导致凝聚并形成稳定的凝血块。这个过程可能与动脉粥样硬化，中风和血栓形成的发病有关。在血管内皮细胞内，活化的PAR4可诱导NO生成[5]。

　　人肥大细胞HMC-1表达PAR2和PAR4，具有抗炎和抗癌效能的姜黄(curcumin)能抑制PAR2和PAR4介导的人肥大细胞激活[6]，机理可能是抑制胰蛋白酶诱导的细胞外信号调节激酶(EPK)磷酸化，即封闭EPK路径。

　　4 PAR4与凝血异常疾病的关系

　　人血小板上存在两种凝血酶受体PAR1 和 PAR4， Kahn 等在PAR3缺陷小鼠的凝血酶反应研究中发现：运用PAR4激活肽能诱发血小板分泌作用和聚集反应，从而提出血液双重受体调节机制，而类似的调节机制也存在于人类。小鼠PAR3自身不介导跨膜信号，而是作为辅助因子裂解活化小鼠PAR4[7]。研究认为PAR1活化能单独完成血小板聚集和分泌，PAR4则对血液凝块稳定起生理学作用[8]。PAR1最大活化时较PAR4最大活化时的血小板结合纤维蛋白素原量少，抑制任何一种受体都使得凝血时间延长。但PAR1在纤维蛋白溶解作用中比较重要，抑制该受体则使纤维蛋白溶解过程的所有阶段都延长;当抑制PAR4受体时血液凝块的弹性显著降低。在凝血酶活性的测量中，抑制PAR4延迟凝血酶起始和其峰值，但是不影响凝血酶活性的总值;抑制PAR1对于凝血酶的活性增加无显著影响。PAR1和PAR4同时表达在人血小板上，共同调节凝血酶信号，可协同除凝血酶外的蛋白酶产生反应。酒精通过抑制PAR4信号和稍后的Ca2+内流及颗粒释放而影响血小板聚集[9]，这可使冠心病患者适量饮用酒精饮料后发病率降低。PAR4在血小板对凝血酶反应中，通过延长升高的Ca2+和活化的磷脂酶A(2)调整血栓素生成。在人类的血小板中PAR4可与相对浓度较低的凝血酶反应，通过YD-3选择性抑制凝血酶诱导的血栓素生成也许对血栓疾病的治疗有益处[10]。

　　PAR4作为凝血酶受体通过影响凝血酶活性以及其它相关的作用因素影响血小板活性。血管紧张素转换酶降解产物缓激肽(bradykinin 1-5,RPPGF)通过结合PAR1和PAR4的凝血酶结合位点而影响凝血酶活性。RPPGF与PAR4的凝血酶裂解位点的肽段结合：RPPGF上N-末端的精氨酸结合PAR4的P2位或者脯氨酸46来封闭凝血酶裂解[11]。嗜中性粒蛋白酶和组织蛋白酶G(cathepsin G)是公认能引起血小板分泌和聚集的蛋白酶，PAR4通过调节组织蛋白酶G的作用来封闭血小板的活性。PAR4可以调节血小板对组织蛋白酶G的反应以及血管损伤或炎症时组织蛋白酶G介导的中性粒细胞同血小板的相互作用。PAR4介导血管壁细胞的凝血酶信号，这些信号可能参与止血作用和凝血作用[12]。在用PAR4+/+骨髓构建的PAR4+/+ 和PAR4-/-小鼠，尾出血时间中位值以及肺栓塞模型存活时间均短于用PAR4-/-骨髓构建的PAR4+/+和PAR4-/-小鼠。PAR4-/-骨髓构建的小鼠出血时间延长和抗凝血作用减弱提示PAR4-/-骨髓构建小鼠血小板缺少PAR4功能，表明血小板的凝血酶信号在止血和凝血的多重路径中的重要性。

　　PAR1和PAR4不仅有聚合血小板的作用还能调节内皮他丁(endostatin)和血管生长因子(VEGF)的释放[13]。PAR4激动剂 [AYPGKF-NH(2)]能引起血小板聚集和内皮他丁释放，抑制VEGF释放。选择性PAR1激动剂[TFLLR-NH(2)]诱导血小板聚集和VEGF释放，但不抑制内皮他丁释放。在选择性PAR1拮抗剂(SCH79797)存在时，凝血酶刺激内皮他丁释放和抑制VEGF释放;在选择性PAR4拮抗剂[transcinnamoyl-YPGKF-NH(2)]存在时，凝血酶则刺激VEGF释放。用PAR1拮抗剂处理胃溃疡的大鼠，结果导致其胃溃疡愈合显著迟缓，因此PARs在调节血管生成、伤口愈合以及肿瘤生长中起关键作用。

　　5 PAR4与炎症

　　PAR4能被凝血酶、胰蛋白酶和组织蛋白酶G等多种酶激活，参与多种病理生理过程，介导细胞因子、炎症介质释放等。在炎症反应中PAR4具有募集中性粒细胞的作用和通过激肽释放酶-激肽系统调节水肿的作用[14] 。在角叉菜胶(carrageenan)引起大鼠后爪水肿的模型中，PAR4拮抗剂能减轻水肿和减少粒细胞募集，而PAR4激动剂则引起以水肿和粒细胞募集为特征的炎症反应，这些都提示PAR4在这个炎症模型中起关键作用。Moffatt等[15]研究认为PAR4介导外源性凝血酶引起适度的急性炎症反应。PAR4在人肺内皮细胞也可能起特殊作用 [16]。PAR1和PAR4相应的肽段分别激活PAR1和PAR4时能诱导肌动蛋白形成，但PAR4诱导形成的肌动蛋白丝多成束状而PAR1诱导形成的肌动蛋白丝多成环状。PAR4激活肽对于p38 MAPK 抑制剂 SB203580显示出高灵敏度。这些结果证实PAR4同PAR1活化时一样也能诱导特殊肌动蛋白纤维(actin fiber)形成，提示PAR4在人肺内可能发挥特殊作用。

　　PAR4广泛分布于肌层组织中，与器官动力学有关，参与其生理及病理学反应。Kawabata等发现凝血酶在调节食管黏膜肌层起双重作用，通过PAR1产生收缩作用，通过PAR4产生舒张作用。PAR4蛋白在结肠上皮表面和黏膜下层表达[17]，活化的PAR4通过TTX释放乙酰胆碱和速激肽，诱导结肠纵肌的收缩，这些作用可能导致肠道损伤和炎症时的肠动力紊乱。Allen等[18]研究人类妊娠以及非妊娠子宫时发现PAR4蛋白存在于子宫肌层细胞上，活化的PAR4能发挥温和的子宫收缩效应，而PAR4拮抗剂则产生温和的子宫舒张效应。

　　PAR4作为新的潜在内源性止痛因子，在正常和炎症条件下能够调节伤害性疼痛反应[19]，在中枢缺血损伤后PAR4可能介导神经变性[20]。在离体的鼠中枢神经后根的感觉神经元中证实PAR4的表达[19]， PAR4-AP能够抑制由KCl和辣椒碱诱发鼠感觉神经元的钙动员，而向细胞内注射PAR4-AP后显著提高了其对热和机械伤害刺激的伤害感受阈。联合应用PAR4-AP和角叉菜胶则显著降低角叉菜胶诱导的炎症痛觉过敏和异常性疼痛，但对于水肿和粒细胞浸润却无作用。目前也有文献提出：PARs介导的凝血酶在局部缺血后的神经变性的过程中起显著作用：PAR1和PAR3介导的凝血酶可能参与诱发局部缺血后炎症，而PAR4则可能与缺血后的神经变性有关。Henrich-Noack等[20]用内皮缩血管肽构建小鼠大脑中动脉闭塞模型和经颅大脑中动脉的永久闭塞模型，运用中枢特殊染色在大脑实质发现：PAR1和 PAR3于损伤后12和24 h开始表达，而不是缺血后7 d。PAR4在正常小鼠和缺血模型中的中枢细胞(neuronal cells)都表达，但是在梗死区域及其边缘PAR4免疫组织化学信号显著增强。

　　6 结语与展望

　　综上所述,虽然人们对PAR4的分布、活化、生物学效应等有了一定的了解,但还需对PAR4 介导的发病机制进行更深入的探索。目前研究认为凝血酶、胰蛋白酶、类胰蛋白酶等能够激活PAR4 , 参与某些凝血异常疾病，呼吸道或非呼吸道疾病的发生、发展过程，深入研究PAR4与这些疾病的病理过程的关系，可以使人们对 PAR4的功能有更加深入的认识。

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