调节破骨细胞分化的ＲＡＮＫ特异性ｃＤＮＡ片段的研究

　　作者：许多荣,罗绍凯,苏畅,方荸荠　　作者单位：中山大学附属第一医院血液科， 广东 广州 510080

　　【摘要】【目的】 在生理条件下寻找调节破骨细胞(OC)分化的核转录因子NF-κB受体激动剂(RANK)的特异性cDNA功能片段，为研究OC分化机制提供理论基础。【方法】 先将RANK膜内部分的1.2 kb大小的cDNA分成20个片段，用缺失突变的方法构建出20个由肿瘤坏死因子受体1和RANK跨膜和膜内部分组成的TNFR1/RANK嵌合体的突变体，每一个突变体在RANK膜内部分含60 bp缺失。再将RANK-cDNA第1 561 ～ 1 680 bp之间的120 bp片段分为10个片段，构建10个新的TNFR1/RANK突变体，每一个突变体在其RANK膜内部分含12 bp缺失。用包装细胞Plat E分别将各突变体包装成逆转录病毒，通过感染分别将这些逆转录病毒转染到肿瘤坏死因子受体1和2基因敲除小鼠的骨髓巨噬细胞(BMM)中。用TNFɑ刺激后、观察哪一个突变体不能诱导OC形成。【结果】 首先发现表达TNFR1/RANK1561-1620或TNFR1/RANK1621-1680的逆转录病毒感染的BMM 不能分化成OC，然后在RANK-cDNA第1 561 ～ 1 680 bp这个大的片段中又发现表达TNFR1/RANK1597-1608、TNFR1/RANK1609-1620、TNFR1/RANK1621-1632或TNFR1/RANK1633-1644的逆转录病毒感染的BMM也不能分化成OC。 【结论】 RANK-cDNA第1 597 ～ 1 644 bp之间的48 bp片段(5′-gggcaggtgatgaacttcaagggtgacatcatcgtggtgtatgtcagc-3′)对OC形成起决定性作用。

　　【关键词】 RANK特异性cDNA片段,嵌合体,破骨细胞; 分化

　　Abstract： 【Objective】 To seek the special functional cDNA fragment in RANK (receptor activator of nuclear factor kappa B) inducing osteoclast (OC) formation under physiological condition to provide a basis for studying the mechanism of OC differentiation. 【Methods】 The 1.2 kb cDNA of cytoplasmic domain of RANK were divided into 20 fragments and constructed 20 mutant TNFR1/RANK chimeras， each consisted of TNFR1 (tumor necrosis factor receptor 1) extracellular domain linked to transmembrane domain and cytoplasmic domain of RANK with a 60 bp deletion in cytoplasmic domain using deletion mutation assay， then the 120 bp cDNA fragment between 1 561 bp and 1 680 bp in cytoplasmic domain of RANK were divided into 10 fragments and constructed other 10 new mutant chimeras with a 12 bp deletion in each. After these mutants were finished， they were packed with Plat E to produce the retrovirus expressing each mutant TNFR1/RANK. We infected BMM(bone marrow macrophage) isolated from TNFR1/R2 double knockout mice with retrovirus derived from different mutants and inspected which BMM infected could not be differentiated into OC after stimulated by TNF-ɑ. 【Results】 We firstly found that BMM infected by retrovirus expressing TNFR1/RANK1561-1620 or TNFR1/RANK1621-1680 could not be differentiated into OC， and then found BMM infected by retrovirus expressing either TNFR1/RANK1597-1608， TNFR1/RANK1609-1620， TNFR1/RANK1621-1632 or TNFR1/RANK1633-1644 could not be differentiated into OC also. 【Conclusion】 The 48 bp cDNA fragment between 1 597 bp and 1 644 bp (5′-gggcaggtgatgaacttcaagggtgacatcatcgtggtgtatgtcagc-3′) in cytoplasmic domain of RANK is crucial for OC differentiation.

　　Key words： special functional cDNA fragment in receptor activator of nuclear factor kappa B; chimera; osteoclast; differentiation

　　核转录因子NF-κB受体激动剂的配体(ligand of receptor activator of nuclear factor kappa B， RANKL)在破骨细胞(osteoclast， OC)分化中起到十分重要的作用[1]，RANKL与位于骨髓巨噬细胞(bone marrow macrophage，BMM)表面上的RANK受体(receptor activator of nuclear factor kappa B， RANK)结合后，再通其过膜内部分调节其下游的NF-kB(nuclear factor kB)、 JNK (Jun N-terminal kinase)、 P38和ERK(extracellular signal-regulated kinase)蛋白的磷酸化来调节OC的分化和功能[2-3]，因此RANK是调节OC分化的关键环节。尽管目前国外已有多位作者报道RANK蛋白膜内部分存在着多个关键区域对OC分化有影响，但他们报道的这些区域的位置各不相同、且存在明显争议[4-5]，因为他们大多数研究是利用细胞株进行的，而不是在生理条件下研究所得出的结果。所以，生理条件下RANK调节OC分化的真正区域尚未被发现。本文通过嵌合体构建技术、基因转染技术、破骨细胞分化实验等方法，在生理条件下利用能分化成OC的小鼠BMM作为研究对象，成功地找到了RANK分子中一个48个碱基(bp)大小的cDNA片段，其对OC分化起决定性作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　野生型C3h小鼠购于美国Harlan Industriy in Indianapolis，肿瘤坏死因子受体基因敲除小鼠(TNFR1-/-R2-/-)购于美国the Jackson Laboratory;质粒pBluescript SK+、质粒PMX-puro、包装细胞Plat E、M-CSF、GST-RANKL由美国阿拉巴马大学伯明翰分校(University of Alabama at Birmingham)分子病理实验室Xu Feng提供; XL1-Blue supercompetent cell、突变试剂盒(QuickChangeTM Sit-direct Mutagenesis Kit) 购于美国Stratagene公司。用于扩增各突变体的cDNA引物均由美国Sigma公司合成。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 细胞培养 CH3小鼠、TNFR1-/-R2-/-小鼠的BMM和包装细胞Plat E培养参考文献[4]操作。

　　1.2.2 在RANK膜内含60 bp缺失的PMX-TNFR1/RANK* 嵌合突变体的构建 将RANK-cDNA从跨膜部位开始到末端(即RANK-cDNA第721 ～ 1 910 bp，共有1.2 kb，400个氨基酸)分为20个片段，每个片段含60 bp(20个氨基酸)，然后分别删除各片段，参考嵌合体TNFR1/RANK构建技术[5]，通过克隆和亚克隆构建20个PMX-TNFR1/RANK* 嵌合突变体(以B1 ～ B20表示)，每一个突变体在其RANK膜内部分含60 bp缺失。

　　1.2.3 在RANK膜内含12 bp缺失的PMX-TNFR1/RANK* * 嵌合突变体的构建 将RANK-cDNA的第1 561 ～ 1 680 bp之间的120 bp片段分为10个片段，每个片段含12 bp(4个氨基酸)，然后分别删除各片段，通过克隆和亚克隆[5]技术，构建10个新的PMX-TNFR1/RANK* * 嵌合突变体(以S1 ～ S10表示)，每一个突变体在其RANK膜内部分含12 bp缺失。

　　1.2.4 表达突变体质粒的逆转录病毒的包装及其感染BMM效率的鉴定 参考我们以前的方法[6]。首先用包装细胞Plat E将所有突变体质粒分别包装成逆转录病毒。然后鉴定其感染效率：设计未感染的BMM作为阴性对照、感染PMX-WT(不含突变的嵌合体质粒)的BMM作为阳性对照。分别用各含突变体的逆转录病毒感染TNFR1-/-R2-/-小鼠的BMM。再分别收集1 × 106个未感染BMM、感染PMX-WT的BMM以及感染各突变体病毒的BMM，作直接免疫荧光标记(direct immunofluore-scence labeling)实验[7]以鉴定TNFR1/RANK的逆转录病毒能否感染BMM，以及感染后TNFR1/RANK蛋白能否表达在BMM的细胞膜上。

　　1.2.5 破骨细胞形成实验 将5 × 104个未经感染的BMM(阴性对照)、感染PMX-WT的BMM(阳性对照)以及感染各突变体质粒的BMM分别加入24孔培养孔中，加入1 mL α10培养液。阴性对照中加入10 ng M-CSF、阳性对照中加入10 ng M-CSF + 100 ng RANKL、各突变体质粒感染的BMM加入10 ng M-CSF + 10 ng TNF-а，作OC形成实验[7]。每隔2 d更换培养液及各细胞因子1次，观察OC形成并进行TRAP染色[6]。

　　2 结 果

　　2.1 表达各突变体的逆转录病毒感染TNFR1-/-R2-/-小鼠的BMM及其表达鉴定

　　直接免疫荧光标记实验结果发现：图1左显示，阳性对照即表达PMX-WT的逆转录病毒感染的BMM细胞表面所携带的荧光比阴性对照(未感染的BMM)明显增强，其峰值明显右移，这表明嵌合体TNFR1/RANK蛋白不仅能成功地表达，而且表达在BMM的细胞膜上。图1右显示，感染嵌合突变体(mutant chimera，MC)的BMM细胞(用一个突变体作代表)与阴性对照相比，表面荧光也明显增强、峰值明显右移，这表明所有嵌合突变体蛋白也能成功地表达在BMM的细胞膜上。

　　2.2 RANK-cDNA膜内部分大片段的发现

　　用未感染的BMM作为阴性对照、感染表达PMX-WT逆转录病毒的BMM作阳性对照、用方法1.2.2节构建的20个突变体(以B1 ～ B20表示)的逆转录病毒感染BMM，收集3种细胞同时作破骨细胞形成实验。结果发现：感染B15(TNFR1/RANK1561-1620)或B16(TNFR1/RANK1621-1680)逆转录病毒的BMM不能形成OC，其余突变体感染的BMM均能分化成OC，图2列出了部分突变嵌合体对OC分化的影响(其余未显示的嵌合体均能诱导OC生成)。这就意味着B15或B16所包含的RANK-cDNA缺失片段对OC的形成起重要作用。而B15和B16所包含的RANK-cDNA缺失片段序列是：1561(5′)- gtgactggaaacagtaactccacgttcatctctagcgggca ggtgatgaacttcaagggtgacatcatcgtggtgtatgtcagccagacctcgcaggagggcccgggttccgcagagccc-(3′)1680。

　　2.3 RANK-cDNA膜内部分小片段的发现

　　用感染PMX-WT逆转录病毒的BMM作为阳性对照，未感染的BMM作为阴性对照，再分别用S1 ～ S10(方法1.2.2中所构建)的逆转录病毒感染BMM，做破骨细胞形成实验。结果我们发现感染表达S4(TNFR1/RANK1597-1608)或S5(TNFR1/RANK1609-1620)逆转录病毒的BMM中有个别OC出现，而感染表达S6(TNFR1/RANK1621-1632)或S7(TNFR1/RANK1633-1644)逆转录病毒的BMM中无OC形成(图3所示)，其余突变体病毒感染的BMM中均出现了OC。为了排除S4、S5中的个别OC由于TNF-α浓度引起，我们将TNF-α浓度从1 × 10-3 g/L升至5 × 10-3 g/L重复破骨细胞形成实验，结果仍一致。这就意味着S4、S5、 S6和S7这4个突变体所含的缺失片段都对OC的形成起决定性的作用，而S4 ～ S7中所包含的缺失片段就是RANK-cDNA中1 597 ～ 1 644的小片段。这一结果表明：在结果2.2发现的1 561 ～ 1 680之间的大片段中，只有1 597 ～ 1 644这个小片段起作用，其cDNA序列是：5′-gggcaggtgatgaacttcaagggtgacatcatcgtggtgtatgtcagc-3'。

　　3 讨 论

　　3.1 RANK在调节OC分化中的作用及目前国外在此方面研究存在的不足之处

　　RANK可分布在BMM的膜上，在骨代谢方面起到重要的作用。RANK受体上游主要存在两个配体即RANKL和OPG，当RANKL和RANK结合后，就可激活其下游的信号途径促进OC形成，起到正向调节作用;而OPG可与RANKL竞争性结合RANK，从而抑制OC的分化和功能，起到负向调节作用。总之，RANKL/RANK/OPG信号轴在调节OC的分化和功能方面起到至关重要的作用[8-9]。目前进一步研究已经证实，当RANKL作用于BMM细胞膜上的RANK受体以后，胞浆内的肿瘤坏死因子相关受体(TNF receptor associated factors，TRAF)就与RANK膜内部分不同部位的结构域(domain)相结合，然后激活其下游的NF-kB、JNK、P38-α及ERK等信号传导途径来调节BMM向OC分化[2，10]。尽管国外已有作者报道RANK蛋白膜内部分存在着多个这样不同的domains，但他们报道的这些domains位置存在很大差别[4-5]。我们仔细分析了他们的结果，发现他们的研究主要存在两个方面的缺陷。①结构方面：由于目前尚无RANK基因敲除小鼠作为研究对象，他们的研究只能在293细胞、Hela细胞或酵母菌等体外一些细胞株中进行，这些细胞株和机体活细胞生理条件相差很远，因而报道这些domains的位置缺乏重复性。②功能方面：他们的研究大多集中在上述细胞株中探讨RANK 不同的domains和TRAF之间是否存在相互作用，很少研究这些domains和TRAF蛋白相互作用后对OC分化和功能的影响，因为他们所应用的细胞株本身不能分化成OC。在我们近期的一组研究中，克服了他们在研究中所存在的缺陷，在生理条件下，利用能分化成OC的小鼠BMM作为研究对象分别突变了目前报道的TRAF在RANK膜内部分的6个结合位点，发现单独突变这些结合位点并不影响OC的分化[11]，所以，我们有充分理由认为：生理条件下，RANK调节OC分化的真正Domain还未找到。

　　3.2 生理条件下RANK结构域的发现及其意义

　　虽然RANK膜内特异性domain还未真正找到，但我们可以肯定的是在RANK膜内部分一定存在一个或多个真正的domain。为了发现RANK生理条件下的domain，我们在本文的研究中，利用曾构建的TNFR1/RANK嵌合体[7]为工具，先将RANK-cDNA从跨膜部位开始到末端(全长1.2 kb)划分为20个片段，结果发现，删除了B15(TNFR1/RANK1561-1620)或B16(TNFR1/RANK1621-1680)所含的RANK缺失片段后，OC就不能形成(图2)，这表明RANK调节OC分化的功能区域就位于这两个缺失片段(即RANK-cDNA第1 561 ～ 1 680 bp之间的120 bp片段)中。由于删除这个片段较大，为了排除空间结构对OC生成所造成的影响，我们又将这个片段分为10个小片段，进一步结果发现(图3)：在S4(TNFR1/RANK1597-1608)、S5(TNFR1/RANK1609-1620)、S6(TNFR1/RANK1621-1632)或S7(TNFR1/RANK1633-1644)这4个突变体中，RANK所含的缺失片段都对OC形成有影响，而且S6和S7所含的缺失片段可能比S4和S5所含的缺失片段更为重要。这一结果表明： S4 ～ S7之间所含的RANK-cDNA缺失片段对OC形成起到至关重要的作用，删除了这个片段，OC就不再形成。所以这个片段可能就是RANK细胞膜内特异性domain，其cDNA结构就是：1597(5′-3′)-ggg caggtgatgaacttcaagggtgacatcatcgtggtgtatgtcagc-1644。

　　这个新发现的cDNA片段含48个碱基，可编码16个氨基酸，是否每一个氨基酸都起到作用尚不清楚。我们目前正在分别突变每一个氨基酸，观察其对OC形成的影响，以期发现这个cDNA片段中的关键氨基酸。这一研究可为将来开发一种防治骨质破坏的药物提供一个特异性靶点。

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