成人骨髓间质干细胞向神经干细胞的诱导分化

　　作者：庄琴1,朱彦1,陆益龙1,唐爱国1　　作者单位：1.江苏大学附属医院血液科， 江苏 镇江 212001; 2.江苏大学基础医学与医学技术学院， 江苏 镇江 212013

　　【摘要】目的：建立诱导成人骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向神经干细胞分化的体外培养方法，为细胞移植修复神经系统损伤提供种子细胞。方法：原代贴壁培养成人BMSCs并传代培养至第3代时，将细胞接种于铺有琼脂糖的培养瓶，用神经干细胞培养基(含B27，EGF，bFGF)抗贴壁诱导培养。将诱导培养的神经球(neurospheres)传代扩增。用免疫荧光染色和蛋白质印迹法，对贴壁培养的BMSCs和抗贴壁诱导培养的神经球细胞表达神经干细胞标志蛋白的水平进行检测和比较。结果：抗贴壁诱导培养可使BMSCs形成神经球，初级神经球传代可扩增形成次级神经球。神经球细胞高表达音猬因子、神经细胞黏附分子以及神经干细胞标志蛋白巢蛋白和CD133。结论：琼脂糖抗贴壁，神经干细胞培养基诱导培养可使成人BMSCs形成神经球，神经球细胞具有神经干细胞样特征，该方法可为细胞移植修复神经系统损伤提供大量的种子细胞。

　　【关键词】 骨髓间质干细胞,神经干细胞,巢蛋白;CD133;神经细胞黏附分子;音猬因子;琼脂糖

　　[Abstract]　Objective： To establish an in vitro method to induce the differentiation of adult human bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) into neural stem cells as the seed cells for the transplant therapy of neural system injuries. Methods： Human BMSCs were isolated from bone marrow and cultured for three passages(P3).The BMSCs were plated to the agarose-coated anti-adherent flasks， using the neural stem cell culturing medium including B27，EGF and bFGF to induce the differentiation of BMSCs to neurospheres. With the passage of neurospheres， neural stem cells(NSCs) proliferated. At last the NSCs markers in adherent cultured BMSCs and anti-adherent plus inducing cultured cells grew as neurospheres were compared with immunofluorescence and Western blotting. Results： Anti-adherent plus inducing culture can derive neurospheres from BMSCs. The primary neurospheres can be passaged to secondary neurospheres with proliferation. The cells in neurospheres expressed sonic hedgehog，neural cell adhesion molecule(NCAM)，as well as the neural stem cell markers Nestin and CD133. Conclusion： The method combining anti-adherent with agarose and NSCs culturing medium can induce the differentiation of adult human BMSCs into neurospheres with NSCs characteristics， and is one promising strategy to provide large quantities of seed cells for repairing neural system injuries.

　　[Key words]　bone marrow mesenchymal stem cells; neural stem cells; nestin; CD133; neural cell adhesion molecule; sonic hedgehog; agarose

　　起源于中胚层的骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是干细胞家族的重要成员，具备干细胞的自我扩增和多向分化特性[1]。BMSCs不仅可被诱导分化为骨、软骨和心肌细胞[2]，亦可诱导跨胚层分化(transdifferentiation )为神经细胞和神经胶质细胞[3-6]。因此，BMSCs被认为是自体移植治疗神经系统损伤的具有临床应用前景的种子细胞之一[7]。但是中胚层来源的BMSCs具有向结缔组织细胞自然分化的趋势。在体外培养扩增的过程中BMSCs向神经分化的潜能是否可长期维持有待研究。我们先前的研究结果表明，第5代的BMSCs向神经细胞分化的能力明显降低 [8]。因此我们认为，将BMSCs诱导分化为神经干细胞，并在体外扩增和维持细胞的干性(stemness)，有利于该细胞移植入体内神经组织后，在局部微环境的诱导下自发性分化，以更好地修复神经系统损伤。基于上述观点，本研究建立了诱导BMSCs向神经干细胞分化的体外培养方法并评价了BMSCs向神经干细胞分化的效果。

　　1　材料与方法

　　1.1　成人BMSCs的贴壁培养

　　取正常成人髂骨骨髓10 ml缓慢叠加于淋巴细胞分离液上层， 2 000 r/min，离心30 min，吸取单个核细胞层，PBS清洗2次后加入DF12完全培养基(10%胎牛血清，45%DMEM， 45% F12)，接种于25 ml培养瓶中，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养，3天后开始更换培养液，去除悬浮细胞，此为原代BMSCs，记为P0。以后每3天更换培养液，当细胞铺满瓶底时，以0.25%胰酶(含0.05%EDTA)消化传代继续培养。传代1次后的细胞称为第1代，记为P1，其余依此类推。当BMSCs传至第3代时，将部分BMSCs(P3)接种于24孔培养板用于免疫荧光染色鉴定，其余细胞用于抗贴壁培养，诱导向神经干细胞分化。

　　1.2　成人BMSCs的抗贴壁培养和向神经干细胞诱导分化

　　将琼脂糖2 g 和100 ml PBS 置于洁净三角烧瓶中，高压蒸汽灭菌，冷却至70 ℃左右时， 吸取约2 ml 的琼脂糖溶胶平铺于25 ml玻璃培养瓶，冷却后琼脂糖于瓶底形成凝胶层(抗细胞贴壁)。将BMSCs(P3)接种于上述抗贴壁培养瓶用神经干细胞诱导培养基(DMEM/ F12 基础培养液含2%B27，EGF 40 ng/ml，bFGF 20 ng/ml)，置于37 ℃，5%CO2培养箱中诱导培养，每天向培养基内加入细胞因子。3天后BMSCs即形成初级神经球(neurospheres)。培养7天后，将初级神经球吸出，以500 r/ min 离心5 min，弃去上清后加入新诱导培养基，用吸管轻轻吹打机械分散神经球。将分散细胞重新接种于抗贴壁培养瓶用神经干细胞培养基继续诱导培养，由此形成的神经球即为次级神经球。重复上述神经球分散传代过程即可扩增获得大量的由神经干细胞形成的次级神经球。

　　1.3　免疫荧光染色

　　1.3.1　贴壁培养的BMSCs的免疫荧光染色

　　将接种于预先铺有圆盖片的24孔培养板内的BMSCs( P3)于培养第3天用4%低聚甲醛固定24 h，PBS清洗2次后用0.25%Triton-X100(含1%BSA)37 ℃孵育1 h;用兔抗波形蛋白，CD29，CD44，CD105的抗体37 ℃孵育3 h; PBS洗3次后加入Cy3标记的羊抗兔IgG 37 ℃孵育1 h，PBS 漂洗3 次，甘油封片后置荧光显微下观察并摄片。

　　1.3.2　神经球的免疫荧光染色

　　将上述悬浮培养的次级神经球(P3)吸出滴加于铺有黏片剂的玻片上用少量培养基孵育2 h，使细胞快速黏附，用4%低聚甲醛固定24 h。0.25%Triton-X100(含1%BSA)37 ℃孵育1h;依次用羊抗CD133和兔抗巢蛋白(双标记)或羊抗SHH(音猬因子)和兔抗NCAM(双标记)抗体37 ℃孵育3 h;PBS 漂洗3次， 依次用FITC标记的驴抗羊IgG和Cy3标记的羊抗兔IgG 37 ℃孵育1 h;PBS 漂洗3次，甘油封片后用荧光显微镜观察并摄片。

　　1.4　标志蛋白的免疫印迹测定

　　1.4.1　样品提取

　　将种植于玻璃培养瓶贴壁培养的BMSCs(P3)用冷PBS清洗2次后，加入100 μl RIPA裂解液(4 ℃)及复方蛋白酶抑制剂(1 ∶100)，用细胞刮子将细胞刮下移至Eppendorf管内，冰浴裂解30 min后，加入等体积2×上样缓冲液煮沸5 min，12 000×g离心后吸取上清分装，-70 ℃储存备用;将悬浮培养的次级神经球(P3)吸出离心，去除上清后加入100 μl RIPA裂解液(4 ℃)及复方蛋白酶抑制剂(1 ∶100)充分吹打裂解30 min，其余处理步骤同上。

　　1.4.2　免疫印迹

　　配制8%聚丙烯酰胺凝胶，每泳道加蛋白样品20 μl或分子质量标准参照物 10 μl，于Bio-Rad垂直电泳仪上电泳，将凝胶中分离的蛋白转印至PVDF膜;将PVDF膜取下，用TBS-T(Tris buffered saline-Tween)漂洗1次， 5%脱脂奶粉TBS-T室温封闭1 h;分别用巢蛋白、CD133、神经细胞黏附因子(neural cell adhesion molecule，NCAM)、音猬因子及GAPDH(内参)抗体室温孵育3 h， TBS-T漂洗30 min;用HRP标记的相应二抗室温孵育1 h;TBS-T漂洗45 min后，ECL-plus发光剂室温孵育5 min，用Typhoon 9400 扫描仪扫描显示蛋白条带。将目的蛋白条带的光密度与内参蛋白条带的光密度的比值作为目的蛋白的相对表达水平。用配对t检验对两组[每组样本(瓶)数为4]细胞的巢蛋白、CD133、NCAM、音猬因子的相对表达水平(均数)进行统计学处理。

　　2　结　果

　　2.1　BMSCs的生长特性及免疫荧光染色结果

　　成人骨髓单个核细胞原代培养24 h，部分细胞开始贴壁生长。培养3天弃去悬浮细胞后，贴壁细胞生长加快。培养至第7天可见细胞呈扁梭形或多角形，随着细胞密度的增高，细胞呈长梭形平行排列或呈漩涡状排列。见图1。免疫荧光染色显示BMSCs(P0，P3)中波形蛋白(vimentin)、CD29、CD44、CD105呈阳性(图2)。图1　原代和第3代骨髓间质干细胞相差显微照片

　　2.2　神经球的悬浮生长特性及免疫荧光染色结果

　　用神经干细胞培养基对神经球抗贴壁培养后，悬浮神经球早期生长较快，当球体直径达到2 mm时，神经球生长缓慢，球体中心出现坏死变黑。将初级神经球吸出吹散重新接种后可形成新的神经球，如此重复培养可获得大量的次级神经球。初级神经球外形不甚规则，细胞界限不清，次级神经球呈球形，细胞界限较明显(图3)。图3　骨髓间质干细胞诱导形成的神经球相差显微照片免疫荧光染色显示神经球细胞中巢蛋白、CD133、NCAM和音猬因子阳性。见图4。

　　2.3　标志蛋白表达水平

　　提取源自贴壁培养的BMSCs(P3)和悬浮培养的次级神经球(P3)的总蛋白，进行免疫印迹检测，用配对t检验对两组细胞巢蛋白、CD133、NCAM，音猬因子蛋白的相对表达水平进行统计学处理，结果表明两组之间差异具有统计学意义(P<0.01)(图5)。图5　神经干细胞标志蛋白的免疫印迹检测

　　3　讨　论

　　骨髓间质干细胞是一种多能干细胞，自从Woodbury首次报道将骨髓基质细胞诱导分化成神经元以来[3]，很多实验室都开展了BMSCs移植修复神经系统损伤的研究工作，在大部分实验中人们都是将贴壁培养的BMSCs移植入体内。由于BMSCs具有多向分化潜能，而且随着体外培养时间的延长，细胞向神经细胞的分化能力下降，我们认为通过贴壁培养扩增BMSC，并直接用于移植修复神经系统损伤不利于移植细胞在体内向神经细胞有效分化。因此本研究将成人BMSCs诱导为神经干细胞并进行扩增，检测神经干细胞标志蛋白巢蛋白、CD133、NCAM、音猬因子在BMSCs来源的神经球细胞的表达水平，为移植该神经球细胞更有效地修复神经系统损伤提供理论基础。

　　本实验首先将成人骨髓单个核细胞贴壁培养扩增至第3代( P3)，用波形蛋白、 CD29、CD44、CD105的抗体进行免疫荧光染色，证明贴壁细胞为BMSCs。此后将BMSCs接种于铺有琼脂糖的培养瓶，用神经干细胞培养基(含B27，EGF，bFGF)抗贴壁诱导培养，成功地将BMSCs诱导为神经干细胞并形成神经球。在诱导培养体系中，琼脂糖不含RGD序列，可防止细胞贴壁分化，培养基内的EGF和bFGF为广泛用于神经干细胞体外培养的必需细胞因子，可促进细胞增殖形成神经球并防止细胞悬浮引起的失巢凋亡(Anoikis)[9-10];B27含有神经干细胞生长所需的各种营养成分，以维持细胞的长期存活[11]。免疫荧光染色和免疫印迹法测定结果表明，用上述培养方法培养获得的次级神经球细胞高表达音猬因子和NCAM以及神经干细胞标志蛋白——巢蛋白和CD133。音猬因子可促进干细胞表达巢蛋白，是维持神经干细胞干性(stemness)的重要因子[12-13];NCAM有利于神经干细胞的相互识别和黏附形成神经球[14];巢蛋白和CD133是神经干细胞的标志蛋白，广泛用于鉴定神经干细胞[15-19]。我们选用上述蛋白评价该方法将BMSCs诱导为神经干细胞的诱导效能是合理和可行的。

　　综上所述，用神经干细胞培养基(含B27、EGF、bFGF)抗贴壁诱导培养可高效地将BMSCs诱导为神经干细胞并可传代扩增。该细胞在体、内外能否被诱导分化或自然分化为神经细胞和神经胶质细胞，有待于进一步研究。

　　【参考文献】

　　[ 1 ]　Tocci A， Forte L. Mesenchymal stem cell： use and perspectives[J]. Hematol J， 2003,4(2)：92-96.

　　[ 2 ]　Ko ON， Lazarus HM. Mesenchymal stem cells： heading into the clinic[J]. Bone Marrow Transplant， 2001,27(3)：235-239.

　　[ 3 ]　Woodbury D， Schwarz EJ， Prockop DJ， et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J]. J Neurosci Res， 2000,61(4)：364-370.

　　[ 4 ]　Muoz-Elías G， Woodbury D， Black IB. Marrow stromal cells， mitosis， and neuronal differentiation： stem cell and precursor functions[J]. Stem Cells， 2003,21(4)：437-448.

　　[ 5 ]　Trzaska KA， King CC， Li KY， et al.Brain-derived neurotrophic factor facilitates maturation of mesenchymal stem cell-derived dopamine progenitors to functional neurons[J]. J Neurochem， 2009,110(3)：1058-1069.

　　[ 6 ]　Brohlin M， Mahay D， Novikov LN， et al. Characterisation of human mesenchymal stem cells following differentiation into Schwann cell-like cells[J]. Neurosci Res,2009,64(1)：41-49.

　　[ 7 ]　Dezawa M， Ishikawa H， Hoshino M， et al. Potential of bone marrow stromal cells in applications for neuro-degenerative， neuro-traumatic and muscle degenerative diseases[J].Curr Neuropharmacol， 2005,3(4)：257-266.

　　[ 8 ]　陈谦，陈静，崔颜宏，等.不同培养代数大鼠骨髓基质细胞向神经元样细胞转分化能力的比较[J].神经解剖学杂志，2009,25(1)：1-5.

　　[ 9 ]　Chow SY， Moul J， Tobias CA， et al.Characterization and intraspinal grafting of EGF/bFGF-dependent neurospheres derived from embryonic rat spinal cord[J]. Brain Res， 2000,874(2)：87-106.

　　[10]　Akesson E， Piao JH， Samuelsson EB， et al.Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres[J]. Physiol Behav， 2007,92(1/2)：60-66.

　　[11]　Dictus C， Tronnier V， Unterberg A， et al. Comparative analysis of in vitro conditions for rat adult neural progenitor cells[J]. J Neurosci Methods， 2007,161(2)：250-258.

　　[12]　Traiffort E， Angot E， Ruat M. Sonic Hedgehog signaling in the mammalian brain[J]. J Neurochem， 2010,113(3)：576-590.

　　[13]　Wu SM， Choo AB， Yap MG， et al.Role of Sonic hedgehog signaling and the expression of its components in human embryonic stem cells[J]. Stem Cell Res， 2010 ,4(1)：38-49.

　　[14]　Boutin C， Schmitz B， Cremer H， et al. NCAM expression induces neurogenesis in vivo[J]. Eur J Neurosci， 2009,30(7)：1209-1218.

　　[15]　Lendahl U， Zimmerman LB， McKay RD. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein[J]. Cell， 1990,60(4)：585-595.

　　[16]　Gilyarov AV. Nestin in central nervous system cells[J]. Neurosci Behav Physiol， 2008,38(2)：165-169.

　　[17]　Pfenninger CV， Steinhoff C， Hertwig F， et al.Prospectively isolated CD133/CD24-positive ependymal cells from the adult spinal cord and lateral ventricle wall differ in their long-term in vitro self-renewal and in vivo gene expression[J]. Glia， 2011,59(1)：68-81.

　　[18]　Peh GS， Lang RJ， Pera MF， et al. CD133 expression by neural progenitors derived from human embryonic stem cells and its use for their prospective isolation[J]. Stem Cells Dev， 2009,18(2)：269-282.

　　[19]　Pruszak J， Sonntag KC， Aung MH， et al.Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations[J]. Stem Cells， 2007,25(9)：2257-2268.