特发性血小板减少性紫癜患者免疫功能的研究

　　作者：张春梅　　作者单位：泰山医学院附属泰安医院，山东 泰安 271000

　　【摘要】目的了解特发性血小板减少性紫癜((idiopathic thrombocytopenic purura, ITP)患者的免疫功能并探讨ITP的发病机制。方法 应用流式细胞术检测41例ITP患者及18例正常对照者外周血淋巴细胞亚群;同时与患者的临床资料进行相关性分析。结果 (1)ITP患者外周血淋巴细胞亚群的表达中，CD19+的表达率明显增加(P<0.01); CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值、CD3CD16+CD56+(NK细胞)的表达率明显降低(P<0.05)。(2)患者外周血CD19+的表达率与患者发病至就诊时间呈正相关(r=0.50，P=0.02),与患者骨髓巨核细胞数值均呈正相关(r=0.62,P=0.002);患者CD3+CD4+的表达率与患者发病至就诊时间呈负相关(r=0.49，P=0.02);患者CD3CD16+CD56+的表达率与患者巨核细胞数值呈负相关(r=0.43，P= 0.04)。结论 ITP患者细胞免疫及体液免疫功能的紊乱可能与ITP的发病有关;ITP患者NK细胞的异常表达可能是ITP的致病机制之一。

　　【关键词】 紫癜,血小板减少性,特发性 免疫功能

　　Abstract:Objective: To investigate the immune function of patients with ITP and research the pathogenesis of ITP. Methods: Lymphocyte subsets on the peripheral lymphocytes were measured by flow cytometry in 41 ITP patients and 18 normal subjects . Results: The expression of CD19+ was higher in ITP patients than that in the normal controls(P<0.01), but the expression of CD3+, CD3+CD4+ CD3+CD4+/CD3+CD8+，CD3CD16+CD56+ was lower in ITP patients than that in the normal controls (P<0.05). The expression of CD19+ had positive correlation with the onset time(r=0.50，P=0.02) and the number of megakaryocyte(r=0.62，P=0.002), while the expression of CD3+CD4+ had negative correlation with the onset time (r=0.49，P=0.02). it was observed that there was negative correlation between the expression of CD3CD16+CD56+ and the number of megakaryocyte(r=0.43，P= 0.04). Conclusion: The disorder of the cellular immunity and humoral immunity function is possibly involved in pathogenesis of ITP. The abnormal expression of NK cells in ITP patients may be related to the pathogenesis of ITP.

　　Key words:purura; thrombocytopenic; idiopathic; immune function

　　ITP的发病目前多认为是由于患者体内产生了针对自身血小板抗原的自身抗体。采用流式细胞术对外周血淋巴细胞亚群进行分析,是目前衡量人体免疫功能状况的较准确的方法之一。我们应用免疫荧光标记及流式细胞术检测41例ITP患者及18例正常对照者外周血淋巴细胞亚群的表达，研究ITP患者免疫功能与其发病的关系，现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料 41例患者标本均取自本院2002年11月～2007年5月血液内科门诊及住院患者，年龄13～61岁，中位年龄34.5岁，男17例，女24例，所有患者均为初发ITP患者,均不伴有其它自身免疫性疾病，诊断及疗效标准符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》，取血前均未应用糖皮质激素或免疫抑制剂;正常对照组18名，其中男8名，女10名，年龄21～52岁，中位年龄32岁。

　　1.2 实验试剂 应用Simultest IMKLymphocyte试剂盒(B.D公司产品，型号为FACScalibur)测定淋巴细胞亚群，包括CD45FITC/CD14PE，IgG1FITC/IgG2PE，CD3FITC/CD19PE，CD3FITC/CD4PE ，CD3FITC /CD8PE ，CD3FITC /CD16PE +CD56PE。ELISA试剂盒由上海太阳生物制剂有限公司提供。

　　1.3 方法

　　1.3.1 血小板悬液制备 ITP患者空腹静脉血4.5 ml置于含有1/10体积抗凝液的离心管中，800 r/min离心15 min，吸取上层液(富含血小板血浆)，进一步按操作规程制备血小板悬液。

　　1.3.2 外周血淋巴细胞亚群的检测 ITP患者空腹静脉血3 ml，肝素(1: 100)抗凝，具体标本处理及分析方法参照试剂盒内说明对41例患者及18例正常对照者的外周血淋巴细胞亚群用流式细胞仪进行检测。分析软件为Simulset(美国BD公司)。

　　1.3.3 PAIgG的检测 采用酶联免疫吸附竞争法检测ITP患者组外周血PAIgG水平,按试剂盒说明进行操作。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件处理数据。实验数据用(%)表示，组间比较采用t检验，对部分指标进行相关性分析。

　　2 结 果

　　2.1 外周血淋巴细胞亚群的分析 外周血淋巴细胞亚群的正常参考范围(由试剂盒生产厂家提供):总B淋巴细胞(CD19+)为5%～18%; 总T淋巴细胞(CD3+)为50%～84%; 辅助性T淋巴细胞(CD3+CD4+)为27%～51%; 细胞毒性T淋巴细胞(CD3+CD8+)为15%～44%; NK细胞(CD3CD16+CD56+)为7%～40%, CD3+CD4+/CD3+CD8+为0.7～1.92。41例ITP患者与18例正常对照者淋巴细胞亚群的表达率的测定结果见表1。表1 ITP患者和正常人淋巴细胞亚群的表达率ITP患者外周血淋巴细胞亚群的表达中，CD19+的表达率明显增高，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD4+/CD3+CD8+以及CD3CD16+CD56+的表达率明显降低，而CD3+CD8+的表达率升高，但无统计学意义。本研究18名正常对照者的测定结果基本与上述数据一致。

　　2.2 ITP患者外周血淋巴细胞亚群表达率与临床资料的相关性分析 见表2。 表2 ITP患者外周血淋巴细胞亚群表达率与临床资料的相关性分析 由表中结果可以看出ITP患者外周血CD19+淋巴细胞亚群与发病至就诊时间(天)呈正相关：r= 0.50，P= 0.02。与骨髓巨核细胞成正相关：r=0.62,P=0.002。ITP患者外周血CD3+CD4+淋巴细胞亚群与患者发病至就诊时间呈负相关：r=0.49;P=0.02 。ITP患者外周血NK细胞与骨髓巨核细胞数值呈负相关：r=0.43，P = 0.04。ITP患者外周血淋巴细胞亚群CD3+的表达率、CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值与患者发病至就诊时间、就诊时血小板数值、治疗起效时间、骨髓巨核细胞数值无明显的相关性。

　　3 讨 论

　　ITP是血液系统常见病之一，其发病目前多认为是由于患者体内产生了针对自身血小板抗原的自身抗体。当机体的某些蛋白分子(如HLADR)与 病原体有相似的抗原决定簇时，机体对这些病原体发生的免疫应答反应和自身成分发生交叉反应，而产生自身抗体，导致自身免疫病。自身抗体的产生与T、B淋巴细胞相互作用是密切相关的。在淋巴细胞亚群中CD3+为总T淋巴细胞，可分为两个重要亚群：CD4+、CD8+。CD4+为辅助/诱导细胞(Th/Ti)，CD8+为抑制/杀伤细胞(Ts/CTL)。在免疫调节细胞中，CD4+细胞和CD8+细胞之间相互诱导、相互制约而形成网络，因此免疫调节细胞是决定内环境稳定的一个中心环节。

　　采用流式细胞术对外周血淋巴细胞亚群进行分析，是目前衡量人体细胞免疫、体液免疫功能状况的较准确的方法之一，我们应用免疫荧光双标记单克隆抗体及流式细胞术对ITP患者淋巴细胞亚群进行测定，发现B淋巴细胞(CD19+)的百分率与正常人比较明显增高，应用ELISA法检测ITP患者PAIgG发现明显高于正常，进一步研究ITP患者CD19+的表达与PAIgG的相关性分析无统计学意义，可能与PAIgG的敏感性有关;从CD19+的表达与患者就诊时间及与骨髓巨核细胞数值的相关性分析，看出ITP患者CD19+的表达与两者均呈明显的正相关性，说明体液免疫在ITP的发病中的重要性。本组ITP患者总T淋巴细胞(CD3+)的百分率与正常对照组比较明显降低，分析认为与B淋巴细胞增多导致的相对减少有关。文献报道在很多自身免疫性疾病中，均存在CD4+T淋巴细胞降低，我们检测ITP患者的淋巴细胞亚群，发现CD3+CD4+细胞率明显下降，CD3+CD4+/CD3+CD8+比值显著减少，差异均有显著意义，与文献报道一致[1]，并且ITP患者CD3+CD4+组与患者的发病时间有明显的相关性，说明ITP患者除体液免疫机制参与自身免疫外，同时存在细胞免疫功能的异常。活化CD4+T细胞可通过Fas/FasL依赖的细胞凋亡机制，介导对自身反应性B淋巴细胞的清除[2]，CD4+T细胞的降低则促进自身反应性B细胞的增殖，产生抗血小板的抗体，破坏血小板。本研究发现的CD19+细胞增多可能正是CD4+T细胞减少造成的。

　　NK细胞是大颗粒淋巴细胞，表达CD16+和CD56+表面抗原。NK细胞通过发挥细胞毒作用和分泌细胞因子, 在机体免疫调节和造血调控等方面发挥着重要的免疫功能。有文献报道SLE患者NK细胞数量减少，因此对B细胞的抑制调节功能减弱，致使SLE患者体内产生大量自身抗体。在慢性肾炎[3]患者NK细胞活性水平显著低于正常对照。本研究发现ITP患者中NK细胞的表达率与对照组比较明显降低，差异显著，与文献报道一致[4]。通过NK细胞与骨髓巨核细胞数值的相关性分析发现，两者呈明显的负相关; NK细胞在免疫监视中有重要作用，可抑制B细胞分泌免疫球蛋白，其减少可导致B细胞产生过多免疫球蛋白，参与ITP患者体内自身抗体的产生，提示NK细胞异常可能与ITP患者致病机制有关。但是Yoshimura C等[1]研究发现在ITP患者中NK细胞的表达率明显增高，因此NK细胞在ITP患者中的真正作用有待进一步研究。

　　通过本研究发现细胞免疫及体液免疫异常参与ITP致病机制，NK细胞的异常可能参与ITP的发病机制，进一步深入研究调节淋巴细胞亚群平衡有助于寻找ITP治疗的新途径。

　　【参考文献】

　　[1] Yoshimura C, Nomura S, Nagahama M, et al.Plasmasoluble Fas (APO1, CD95) and soluble Fas ligand in immune thrombocytopenic purpura[J]. Eur J Haematol, 2000 ,64(4):21924.

　　[2] Rathmell JC, Cooke MP, Ho WY, et al. CD95 (Fas)dependent elimination of selfrelative B cells, upon interaction with CD4+ T cells[J]. Nature, 1995, 376:181184.

　　[3] 任野平,安慧霞,郭德先,等.慢性肾炎NK细胞活性的研究[J].哈尔滨医科大学学报，2001，5：2325.

　　[4] Nagafuchi H, Shimoyama Y, Kashiwakura J,et al.Preferential expression of B7.2 (CD86), but not B7.1 (CD80), on B cells induced by CD40/CD40L interaction is essential for antiDNA autoantibody production in patients with systemic lupus erythematosus[J]. Clin Exp Rheumatol, 2003 ,21(1):7177.