慢性髓系白血病首发血小板显著增多

　　作者：沈群,周建伟,朱光荣,杨月艳,仇海荣　　作者单位：南京医科大学公共卫生学院分子毒理研究室，南京 210029

　　【摘要】本研究探讨以血小板显著增多首发的慢性髓系白血病(CML)临床、细胞遗传学及分子生物学特征。应用骨髓细胞涂片、骨髓活检观察细胞形态学改变;RT-PCR检测bcr/abl融合基因;常规染色体核型分析及FISH检测细胞遗传学变化。结果发现：以血小板显著增多为首发表现的CML是一组具有独特临床和生物学特点的疾病，骨髓细胞涂片和骨髓活检表明，骨髓增生活跃，以巨核系异常增生为主，血小板大片成堆，可见圆形核小巨核细胞，中等度白细胞增多，经细胞遗传学和分子生物学检测均证实存在有Ph染色体和(或)表达bcr/abl融合基因，对此类患者应该早期进行积极治疗，甚至进行分子生物学水平的干预;而原发性血小板增多症(ET)患者则不宜过多地使用化疗药物，否则反而诱致白血病的发生。结论：对血小板明显增多的患者应及时进行Ph染色体及bcr/abl融合基因表达水平的检测，这对于ET及CML的诊断和鉴别诊断极为重要，以避免误诊、误治。

　　【关键词】 原发性血小板增多症

　　Abstract This study was aimed to investigate the clinical，pathological and biological features of a special case of chronic myeloid leukemia (CML) with marked thrombocythemic onset. The morphological changes of cells were analyzed by using bone marrow smear and biopsy; Ph chromosome，a specific marker of CML，was assayed by conventional chromosomal analysis and fluorescence in situ hybridization，bcr/abl fusion gene was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction. The results indicated that CML mimicked essential thrombocythemia (ET) at presentation was relatively rare and might be misdiagnosed as ET，bone marrow smear and biopsy revealed，marked thrombocytosis and moderate leukocytosis; RT-PCR，FISH and conventional chromosomal analysis demonstrated the existance of Ph chromosome and bcr/abl fusion gene.This special CML could progress into accelerated phase or blast crisis.The megakaryocytes in Ph+ ET were smaller than normal ones and had typically hypolobulated round nuclei.Patients diagnosed as Ph+ ET might progress into CML and showed a high tendency to myelofibrosis and blastic transformation. It is concluded that the value of routine cytogenetical and molecular biological analysis in diagnosis for potential CML cases，which mimicked ET as in this presentation，is very distinctive，and the importance is magnified by the recent availability of imatinib，a specific inhibitor of the bcr/abl tyrosine kinase produced by the Philadelphia chromosome.Every case of “ET” should be tested for the Philadelphia chromosome and bcr/abl transcript.

　　Key words essential thrombocythemia; chronic myeloid leukemia; Ph chromosome; bcr/abl fusion gene

　　原发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)和慢性髓系白血病(CML)属于骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disorder，MPD)家族，但两者发病时的表现通常不同，自然病程也不同。最新的资料表明，每个拟诊ET的病例必须进行Ph染色体的分析[1]。世界卫生组织(WHO)的诊断标准也明确，ET的诊断必须排除Ph染色体及bcr/abl融合基因阳性[2]。因为ET和CML的鉴别诊断非常重要，且对采用Ph染色体基因产物靶向治疗的有效性更具指导意义。本研究通过实例探讨以血小板显著增多为主要表现CML的细胞遗传学和分子生物学特征，从而提高对ET及CML的认识，以免误诊、误治。

　　材料和方法

　　病例

　　患者，女，34岁。因“发现血小板增多2月，头昏、乏力2天”，于2005年5月收治入院。患者2月前因腰痛、双手指瘙痒在外院就诊。当时血常规检查显示： WBC 12×109/L，Hb 82.8 g/L，Plt 2 524×109/L。骨髓检查：巨核细胞824个，产血小板巨核细胞315个，血小板成堆可见，考虑为“ET”。予羟基脲口服1.5月，血小板基本恢复正常。近2天来患者自觉乏力、恶心、纳差、腰痛而来我院就诊。入院当天血常规检查：WBC 14.6 ×109/L，N 86%，L 11%，E 1%，B 2%，Hb 51g/L，Plt 2365×109/L。大便隐血(+)。骨髓常规及骨髓活检提示巨核系异常增生，巨核细胞体积较小，多为不分叶圆核型;常规染色体核型分析、FISH及RT-PCR检测发现Ph染色体及bcr/abl融合基因;多次中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)积分明显减低;嗜碱性粒细胞比例增高。诊断：慢性髓系白血病、上消化道出血。

　　细胞形态学检测

　　骨髓细胞涂片 常规瑞氏染色后，光镜下计数250个有核细胞，分析各阶段细胞形态及比例;全片计数巨核细胞，并分析100个巨核细胞形态。同时分析外周血涂片，并进行白细胞分类及血小板形态分析。

　　骨髓活检

　　以10%福尔马林固定骨髓活检标本，常规石蜡包埋、切片、伊红染色，光镜下分析骨髓组织细胞分布及构成。

　　细胞遗传学检测

　　常规骨髓细胞染色体核型分析 抽取肝素抗凝的骨髓5 ml，计数后按(1-2)×106/ml进行直接法制备染色体标本，然后进行R显带处理。每例平均分析20个细胞，按《人类细胞遗传学国际命名体制[ISCN(1995)]进行核型描述，每例标本的核型至少需经2人共同鉴定。剩余的细胞悬液储存于-20℃，供FISH检测。

　　骨髓染色体制备：

　　① 用0.2%肝素湿润之针筒抽取骨髓，根据细胞计数，将骨髓按(1-2)×106/ml，加入20 ml RPMI 1640培养液，37℃恒温箱放置24小时;② 加入秋水仙碱，终浓度为0.05 μg/ml，于37℃放置1小时;③ 离心： 200×g×10分钟，弃上清液;④ 低渗：加入预温至37℃的0.075 mol/L KCl液8 ml，轻轻打匀，于37℃放置30分钟;⑤ 预固定：加入1 ml固定液轻轻打匀，200×g×10分钟;⑥ 第1次固定：离心后弃上清液，加固定液8 ml，打匀，于室温放置≥30分钟;⑦ 第2次固定： 200×g×10分钟，离心后弃上清液，加固定液8 ml，打匀，于室温放置≥15分钟;⑧ 第3次固定： 200×g×10分钟，离心后弃上清液，加固定液8 ml打匀，室温放置≥15分钟;⑨ 离心： 200×g×10分钟，弃上清，加适量固定液配成细胞悬液，于4℃保存;⑩ 气干法制片后，10%姬姆萨染色20分钟，水洗，干后镜检。

　　荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH) ①探针制备： 采用BCR/ABL双色探针，BCR结合绿色荧光SpectrumGreen，ABL结合红色荧光SpectrumRed，探针购自美国Vysis公司; ②间期FISH： 取出储存于-20℃的染色体标本，换用新鲜的3∶1甲醇/冰醋酸固定液，气干法滴片;37℃ 2×SSC中30分钟老化，70%、85%、100%的乙醇室温下梯度脱水，每梯度2分钟;在变性液(70%的甲酰胺/2×SSC)中72℃变性3分钟，70%、85%、100%的冰乙醇(-20℃)梯度脱水，晾干。按1 μl BCR/ABL双色探针加4 μl杂交稀释液加入Eppendorf管中，瞬时离心混匀.把探针与稀释液的Eppendorf管放入72℃水浴锅中变性5分钟。按每张玻片加5 μl的反应体系后，将该玻片盖紧，用胶封牢后置37℃湿盒中杂交过夜，将杂交后的片子放于72℃，0.3% TritonX-100/0.4×SSC中洗涤2分钟，继之用0.1% Triton X100/2×SSC室温洗涤1分钟。避光晾干后按每片加6 μl DAPI/Antifade复染。 ③荧光显微镜检查：用OlympusBX60荧光显微镜，在DAPI/FITC/Texas Red滤色镜的激发下观察间期细胞的荧光杂交信号，每例分析200-300个细胞，不计数重叠细胞。以患者3个或1个荧光杂交信号的百分率大于每种探针对照组X+3SD作为克隆性异常的阳性标准。用Kodak Ektapress PJC800负片摄片或应用染色体图像及多彩色荧光原位杂交自动分析仪进行图像采集和分析。

　　分子生物学检测

　　RT-PCR RNA抽提试剂TRIZOL、Taq 酶、oligodT(36)AGC、引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司提供;M-MLV、dNTPs(Promega公司);阳性对照K562细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。TRIZOL 一步法提取患者骨髓细胞总RNA，用紫外分光光度计(Beckman DU650)检测定量之后将RNA统一稀释成1 μg/μl。RT反应：取RNA 2 μl (2 μg)，oligodT(36)AGC 3 μl，ddH2O 9 μl混匀离心，70℃，4分钟，放置冰上3分钟，离心之后冰浴条件下加入5×缓冲液6 μl，dNTPs(5 mmol/L)1 μl，M-MLV 0.5 μl，ddH2O 8.5 μl，总体积为30 μl，42℃ 90分钟后，70℃ 5分钟灭活反转录酶。PCR反应：取RT产物2 μl，引物各0.5 μl，5 mmol/L dNTPs 1 μl，10×扩增缓冲液(无MgCl2)5 μl，25 mmol/L MgCl2 7 μl，Taq酶0.5 μl，以ddH2O将体积补充到50 μl，混匀，置PCR仪上(PTC2000型)。95℃预变性5分钟之后，95℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35个循环;最后72℃延伸10分钟。bcr/abl引物序列：bcr引物序列为5’-CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG-3′，abl引物序列为3’-AGACTGAAACTCGGAGTCCCAGAC-5’，abl反义引物序列为3’-TTCGGGAAGTCGCCGGTCATCGT-5’。根据bcr/abl 不同拼接方式，可产生168 bp(b3a2)和93 bp(b2a2)两种转录本。β-actin(271 bp)为内对照，引物序列：有义链：5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3’，反义链：5’-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3’。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，紫外照相。

　　结果

　　骨髓涂片及骨髓活检结果

　　骨髓细胞涂片 骨髓增生明显活跃，粒∶红=0.89;巨核细胞530个，分类100个，产血小板巨核细胞42个，血小板成堆大片易见，可见圆形核小巨核细胞。外周血涂片见多量大簇血小板，积聚成大片(图1)。铁染色：胞外铁阴性，胞内铁阴性。NAP阳性率30%，积32分(正常对照60分)。1月后复查骨髓：骨髓增生活跃，粒系59.5%，红系24%，粒∶红=2.48;巨核细胞60个，产血小板巨核细胞15个，可见小巨核细胞，血小板大簇易见。NAP阳性率19%，积19分(正常对照70分)。

　　骨髓活检

　　造血组织增生异常，以巨核系异常增生为主。造血组织∶脂肪∶骨小梁为52%∶22%∶24%。巨核细胞较小，多为不分叶圆核型(图2)。

　　RT-PCR结果

　　分别两次骨髓样本RT-PCR结果： bcr/abl融合基因阳性，b3a2型(图3)。

　　染色体核型分析及FISH结果

　　骨髓细胞染色体核型分析：46XX，t(9;22)(q34;q11)[10]。间期FISH证实存在Ph染色体(图4)。

　　治疗

　　入院后立即予治疗性血小板单采以及控制消化道出血、补铁等其他对症处理，并予羟基脲治疗，但患者用药后呕吐频繁被迫停药。为有效控制血小板数，曾予小剂量HA联合治疗[高三尖杉酯碱(H) 1 mg/d，阿糖胞苷(A) 10 mg/12 hours]，10天后血常规示：WBC 1.8×109/L，N 69%，L 27%，M 4%，Hb 61 g/L，plt 542×109/L。以后常规皮下注射-干扰素300万单位，隔日1次，血小板数控制在430×109/L左右，目前单用干扰素维持。贫血经补铁治疗后明显改善。门诊随访半年，病情稳定，贫血完全纠正，血小板数正常。

　　讨 论

　　原发性血小板增多症(ET)是一种慢性骨髓增殖性疾病(MPD)，其血小板增高并不是其他MPD的发病原因，也不是诊断性症状。由真性红细胞增多症研究小组(PVSG)提议的诊断标准，包括无Ph染色体或分子等价值的bcr/abl转录本[3]。Ph染色体是CML的标志，它是由9号染色体和22号染色体长臂之间的交互易位所引起的，即[t(9;22)(q34;q11)]，断裂的bcr和abl基因形成嵌合的bcr/abl转录本，而该mRNA编码具有转化能力的融合蛋白极可能是CML的基础，中位总生存时间为5年。而ET预后较好，患者的总生存时间与正常人群并无明显差异。CML和ET的治疗及预后相当不同，进行两者间的鉴别诊断是非常必要的。尽管如此，对某些病例的评估和界定仍很难，因为极少数CML最初诊断时仅有血小板增高，有或没有Ph染色体的表达[3-6];而少数ET患者外周血白细胞中可检测到bcr/abl转录本，但其表达水平明显低于CML患者，且Ph染色体阴性[7]。

　　本例患者首发表现为典型的ET，包括持续非常高的血小板计数;无脾肿大，白细胞明显增多;外周血片及骨髓细胞分类无明显中幼粒细胞和晚幼粒细胞异常增生等。而多次NAP染色积分明显减低;骨髓常规检查结果和骨髓活检以及细胞和分子水平发现的Ph染色体及bcr/abl融合基因等均支持CML的诊断。该类患者做出最后诊断时需与ET相鉴别。WHO有关ET确定诊断的定义为：血小板持续在600×109/L以上，骨髓活检显示以巨核系增生为主，大成熟巨核细胞增多[2]。ET患者的最大威胁是血栓或不常出现的出血并发症，大多可为有效的治疗所预防，远期疗效好，寿命近乎正常[8]。与CML相比，在没有引致白血病的化疗下，仅有5%的患者进展为急性白血病。由此可见，ET的患者不宜过多地使用化疗药物，否则反而诱致白血病的发生，这是极其重要而关键的问题，必须引起临床医师的高度重视[9]。相反，疑似血小板显著增多为首发表现的CML患者，一旦经细胞遗传学和分子生物学检测证实存在Ph染色体和(或)表达bcr/abl融合基因，应该早期进行积极治疗，甚至分子生物学水平的干预。因为几乎所有CML患者在5年以内进展为致死性的急性白血病，而新的靶向性分子治疗使这种状况得到了很大的改善。某些ET和CML表现并不典型，出现重叠特征。在分类上的挑战，很容易通过证明是否存在Ph染色体易位的bcr/abl融合基因而得以解决[10，11]。应当指出的是，对于诊断时仅有血小板增高而常规细胞遗传学分析有或没有Ph染色体的表达的CML，应用特异性更强的FISH等技术定期跟踪检测Ph染色体、bcr/abl融合基因就显得尤为重要[12]。

　　Rice等[1]最近报道了2例具有绝对典型ET特征的女性患者，包括极度的血小板增多，无白细胞增多，无嗜硷性细胞，无外周不成熟细胞，无脾肿大。该研究小组认为CML可呈现典型的ET表现，尽早采用常规Ph染色体检测将使靶向治疗的有效性以及早期治疗的优效性更加明显[3]。但所推荐标准并未被临床医师所重视，而仅在进展为加速期时，为确立CML的诊断方才实施染色体的检测。专家建议，CML存在的线索可为骨髓中嗜硷性细胞>3%和小而不典型的巨核细胞[4]。本研究介绍患者在骨髓常规和骨髓活检中均发现较多的不分叶圆核小巨核细胞，与文献报道一致。

　　值得关注的是，CML在整个早期临床病程中其临床表现在各方面可与ET很相似，主要出现严重的血栓并发症。甲磺酸伊马替尼(一种对Ph染色体所致具很强酪氨酸激酶活性p210bcr/abl的特异抑制剂)早期使用便可能更快速地控制血小板数，防止血栓并发症，并免于氯咪喹酮和羟基脲的毒性;在疾病加速之前，尽早启用伊马替尼可改善预后，且可避免实施骨髓移植的需要[11，13]。真性红细胞增多症研究组(PVSG)近来不断强调有ET表现时须进行bcr/abl的分子检测[14]。在表型为CML的情况下，DNA或RNA探针能检出相对不常见的bcr/abl易位，而此可为常规细胞遗传学检测所遗漏。

　　bcr/abl融合基因作为CML的主要标志，能否在ET患者中检测到尚存在争议[15]。Hsu等[7]应用RT-PCR技术检测了63例MPD患者(其中包括CML，ET，PV)以及51例健康志愿者外周血bcr/abl融合基因在mRNA的表达。结果发现，4/30例ET(13.3%)，17/17例CML(100%)，0/16例PV(0%)以及1/51健康者(1.9%)具有bcr/abl转录本。进一步的半定量PCR分析显示，bcr/abl转录本在1例正常人及4例ET患者的表达强度为CML患者的1/1 000至1/10 000。由此可得出，Ph染色体阴性的ET患者外周血白细胞中可检测到bcr/abl转录本，但其表达水平远低于CML患者。Damaj等[16]通过大宗研究资料试图验证一种新的变异性ET的假设。他们分析ET患者121例。多重RT-PCR检测bcr/abl转录本，仅有2例bcr/abl阳性，且在诊断时有轻度嗜碱粒细胞增多。由此可见，bcr/abl转录本在确诊为ET的患者中是极为罕见的，典型的ET不表达bcr/abl融合基因。有明显ET和嗜碱粒细胞增多的少数患者极可能是CML和典型ET间一种新的中间状态，更好地深入开展bcr/abl表达“ET”的临床和生物学特征的前瞻性研究是非常重要的。

　　Michiels等[17]对23例曾描述为Ph+的ET患者的临床症状、血液学特征以及自然病程进行了评估。23例的骨髓涂片及活检中出现小的单个核巨核细胞，与反应性血小板增多相比，Ph+血小板增多者巨核细胞更小，典型的为不分叶圆核型。与Ph-的真正的血小板增多症具有成簇的成熟而增大的巨核细胞相比则相反。Ph+血小板增多患者显示骨髓纤维化和白血病转化的高趋势。这提示Ph+血小板增多和CML相关的Ph+血小板增多均可被认作是CML慢性期的早期表现。

　　综上所述，为典型的ET患者建立常规细胞遗传学和分子生物学检测体系，并观察确认CML的可能，对于采取适当的初始治疗及根据所预期的不同结果进行早期干预是十分必要的。

　　【参考文献】

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