猕猴单倍体相合外周血造血干细胞移植后多种细胞因子mRNA表达的动态分析

　　作者：黄雅静,孙琪云,刘丽辉,胡恺勋　　作者单位：军事医学科学院附属医院血液科，北京 100071

　　【摘要】本研究分析猕猴单倍体相合造血干细胞移植前后外周血单个核细胞中细胞因子(TGF-β，IL-2，IL-6，IL-10，IFN-γ，TNF-α，FAS-L)mRNA的表达并探讨这些细胞因子在急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生和病理变化中的作用，以寻找能够早期预测和鉴别诊断aGVHD的指标。5例猕猴经非清髓预处理后接受单倍体相合外周血造血干细胞移植;半定量逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测移植前后8种细胞因子mRNA的表达，动态观察这些细胞因子在移植后aGVHD中的表达情况。结果表明： 5例猕猴均成功获得造血重建。1例移植排斥，长期无病存活;其余4例为混合嵌合和完全嵌合植入，1例低比例嵌合植入经第二次输注供者外周血造血干细胞后获得高比例嵌合植入;1例发生肠道Ⅲ度GVHD。移植前后体内Th1和Th2类细胞因子都有不同程度的变化，在aGVHD期间TGF-β呈下调表达，其余均为上调表达;植入比例减低的猕猴各细胞因子也下降至移植前水平。结论： TGF-β在aGVHD发生前的下降趋势可能是GVHD预测指标，并且能够作为肠道GVHD的鉴别诊断指标。

　　【关键词】 造血干细胞移植

　　Abstract This study was aimed to analyze the mRNA expression of cytokines (TGF-β，IL-2，IL-6，IL-10，IFN-γ，TNF-α，FAS-L)in five rhesus treated with haploidentical peripheral blood stem cell transplantation after nonmyeloablative preparative regimens and to explore the role of these cytokines in the development and pathology of acute graft-versus-host-disease (aGVHD). Five rhesus monkeys received nonmyeloablative haploidentical peripheral blood stem cells transplantation. Semi-quantitative reversed transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)was used to analyze the kinetics of cytokine mRNA expression in the transplantation and aGVHD. The results showed that five rhesus monkeys acquired hematopoietic reconstitution successfully. The graft was rejected in one monkey which survived without disease，the other four achieved mixed chimerism and full donor chimerism. Chimerism of low centigrade in one monkey achieved high centigrade at 35 days after donor stem cell infusion. Intestinal aGVHD grade Ⅲ developed in one monkey. Cytokines of Th1 and Th2 changed after transplantation. In period of aGVHD，expression of TGF-β decreased but all others increased in various levels. When donor chimerism decreased，the cytokines decreased accordingly. It is concluded that the decrease of TGF-β mRNA may be an indicator to predict aGVHD，and can be used as a differential diagnostic indicator for intestinal GVHD.

　　Key words hematopoietic stem cell transplantation; haploidentical perpheral blood stem cell transplantation; graft-versus-host-disease; cytokine; rhesus monkey

　　非清髓造血干细胞移植在治疗恶性血液病中显示了优势，如适应年龄扩大、并发症减少、急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生率低，且严重度轻等[1]。然而，对于许多患者来说，由于缺乏人类白细胞抗原(HLA)配型相合的供者而丧失了移植治疗的机会。单倍体相合移植的研究是解决这一问题的一个途径，但是由于HLA差异较大，GVHD的发生率增高，严重度增加。目前认为，GVHD的发生发展与“细胞因子风暴”的作用有关[2]。细胞因子间可以相互诱生，引起瀑布样效应，同时又可以相互调节保持平衡。本研究采用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测猕猴单倍体相合移植前后外周血单个核细胞中细胞因子(TGF-β，IL-2，IL-6，IL-10，IFN-γ，TNF-α，FAS-L)mRNA的表达，观察细胞因子在单倍体移植过程中的动态变化，寻找能够早期预测和鉴别诊断aGVHD的指标，探讨这些细胞因子在aGVHD的发生中的作用。

　　材料和方法

　　实验动物

　　健康猕猴10只(购自军事医学科学院动物中心)，进行亲代→子代间或同胞间非清髓异基因外周造血干细胞移植(Allo-NST)，动物饲养合格证号SCXK-(军)2002-001。供受者间MHC配型用混合淋巴细胞反应法(MLR)按常规方法进行，最后计算刺激指数(SI)，单向SI供受者=R供S受 OD/R供S供 OD，结果SI均>3。

　　供者猴外周血干细胞动员和采集

　　用G-CSF 10 μg/(kg•d)(惠尔血，Kirin公司)，分2次皮下注射，动员供者的外周血干细胞，动员后第5天、第6天查血象，WBC上升至>40×109/L时用CS3000plus血细胞分离仪分离外周血干细胞，每次分离单个核细胞约50 ml，计数，用流式细胞仪测定CD34+细胞的含量。

　　非清髓性预处理和GVHD预防

　　预处理前先进行肠道准备(庆大霉素4万单位口服，1次/日)共5天。预处理和GVHD预防具体如下：氟达拉宾(Flud)： 50 mg/(m2•d)(移植前4天-移植前2天)，环磷酰胺(CTX)： 45 mg/(kg•d)(移植前4天，移植前2天)，全身照射(TBI)： 2 Gy (0天，Co60剂量率0.3 Gy/min)，马抗人胸腺细胞球蛋白: 5 mg/(kg•d)(移植前4天-移植前2天)，甲基强的松龙: 2 mg/(kg•d)(移植前4天-移植前2天)，1 mg/(kg•d)(移植前1天-移植后2天)，环胞菌素(CSA)： 6 mg/(kg•d)(移植前4天-移植后35天)，(监测CSA浓度，据其调整CSA用量，使CSA浓度维持在200 ng/ml左右)，霉酚酸酯(MMF)： 40 mg/(kg•d) (移植前4天-移植后35天)，鼠抗人CD25单克隆抗体(塞尼哌)： 1 mg/kg(移植后1天，4天，8天)。

　　嵌合状态分析

　　移植后抽取7、14、21、30和60天的外周血及7、14、30和60天的骨髓，用PCR法检测嵌合水平。本研究建立了短串连重复序列-聚合酶链反应(STR-PCR)相对定量检测移植后猕猴造血嵌合体的方法。对于供受体性别不同的猕猴，采用性别位点(amelogenin基因位点)进行嵌合体分析;对于性别相同的猕猴，采用6个猕猴STR位点(D4S2365，D15S644，D18S536，D7S826，D11S2002和D10S611)进行嵌合分析。简要的步骤为：移植前供者和受者标本分别用上述STR位点的特异性引物扩增，获得最少2个能区别供受体的位点(有信息位点);移植后用有信息位点的特异性引物进行PCR扩增。PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色分离鉴定;用凝胶成像分析仪分析供者和受者特异性DNA条带的密度比值，由此估算出扩增前混合样本中供受者成分的比值。敏感性约为1%-2.5%。实验结果重复2次以上，以排除实验误差[3、4]。

　　血液标本采集

　　分别于以下时间采集外周血标本3 ml： ①移植预处理前;②输注造血干细胞前2小时;③移植后7、14、21、28和60天;④移植后出现皮疹、腹泻、发热及其它症状的猕猴在症状出现2小时内尚未治疗时及症状控制后。血液标本用4%枸橼酸钠抗凝，淋巴细胞分离液(Ficoll，比重1.077)分离外周血单个核细胞。

　　细胞因子检测

　　用TRIZOL法提取单个核细胞总RNA，RT-PCR法检测细胞因子mRNA的表达变化，选择β肌动蛋白(β-actin) 作内参照。查GenBank得到猕猴各细胞因子和β-actin的cDNA或mRNA序列，应用Primer3软件设计引物，通过BLAST软件校对。引物的序列见表1。实验主要步骤如下：取2 μg RNA，逆转录为cDNA; 20 μl PCR体系包括1 μl cDNA，10×PCR buffer 2 μl，Taq酶1 U，dNTP 2 μl，目的片段上下游引物各10 pmol，β-actin上下游引物各2.5 pmol。退火温度及循环数根据PCR预实验确定，使目的片段和内参照的扩增均处于指数增长期且尚未达到饱和时。取PCR产物5 μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像处理系统分析电泳结果。将各细胞因子电泳条带与内参照进行辉度比较得出积分。　　      结 果

　　植入与存活

　　移植输注的MNC数量为(5-10)×108/kg(受者体重)，CD34+细胞数为(1.2-4)×106/kg(受者体重)，白细胞和血小板数于移植后1天-4天降至最低，造血恢复时间为移植后6天-13天。5只猕猴均成功获得造血重建。死亡2只，其中1只于移植后61天死于肠道急性GVHD，另1只于移植后52天死于肾功能衰竭;存活3只的存活时间均超过60天。例1移植排斥，长期无病存活;其余4例移植后均获得供者造血干细胞的混合嵌合植入或完全嵌合植入。例4由移植后30天的低比例嵌合植入(45%)经二次输注供者外周血造血干细胞后获得高比例嵌合植入(85%)(表2)。

　　aGVHD

　　例2于移植后21天出现腹泻，大便为黄色水样便，每天量约80-120 ml，体温正常，无明显感染灶，大便培养见大肠杆菌，给于甲基强的松龙、抗CD25单克隆抗体、FK506等药物治疗，于移植后40天症状减轻，大便转为糊状，但是体重逐渐下降，白蛋白量持续减低，于移植后61天全身耗竭死亡，病理检查证实为肠道Ⅲ度aGVHD。例3和例5均由混合嵌合植入转化为完全供者嵌合植入，未见aGVHD表现;例1移植排斥，例4获得混合嵌合植入，均未见aGVHD表现。

　　感染

　　例3于移植后1天出现体温升高，超过39℃，双肺有散在湿啰音，给与抗生素抗感染、输血支持治疗，移植后14天造血恢复后体温恢复正常，未闻及肺部湿啰音。

　　细胞因子检测

　　Th1类细胞因子(IL-2，TNF-α，IFN-γ)的变化 5例猕猴均在移植的当天或移植后7天时出现各细胞因子升高。例1随着移植排斥各细胞因子逐渐降低到移植前水平;例2在出现aGVHD期间这些细胞因子升高，IFN-γ和IL-2均在症状最重的移植后28天达到峰值，之后随症状的控制而下降，TNF-α增高的幅度不大;例3观察到3个因子在移植后7天升高，移植后14天略有恢复，IFN-γ甚至低于移植前表达水平;例4移植后14天各因子升高到峰值，之后逐渐降低，移植后60天又有升高;例5呈现缓慢增高趋势。

　　Th2类细胞因子(IL-6，IL-10)的变化

　　例1随着移植排斥IL-6逐渐减低到移植前水平;例2急性GVHD期间IL-6升高，移植后28天达峰值;IL-10的升高在例1和例3出现在移植后7天，例2在aGVHD期间观察到IL-10明显升高;例4在移植后14天两因子均达到峰值，之后减低，移植后60天回升;例5中IL-6变化不大，IL-10在移植后2-4周内升高。

　　TGF-β的变化

　　例1和例5中未见TGF-β的明显变化;例2从移植后7天开始观察到TGF-β表达的减低趋势，在开始出现临床GVHD症状的移植后21天达最低值，之后表达逐渐回升;例3于移植后14天TGF-β升高，移植后7天时无变化;例4中TGF-β从预处理开始即升高，移植后28天时基本降至移植前水平，移植后60天又有升高(图3)。

　　FasL的变化

　　在移植后14天-28天FasL表达升高;例1、3 、4、5均在移植后的1-3周内才有升高表达。

　　讨论

　　aGVHD是单倍体相合异基因造血干细胞移植的重要并发症之一。以往的研究表明，细胞因子的表达变化、构成比例以及多态性等因素在aGVHD发生发展过程中起了重要的作用[5，6 ]。Th1类细胞因子对aGVHD起到了放大作用，而Th2类细胞因子对aGVHD起到了抑制作用。本实验检测了Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α和Th2类细胞因子IL-6、IL-10，以及TGF-β和FasL在移植前后的变化，结果发现，例2在aGVHD过程中，Th1类细胞因子和Th2类细胞因子均有不同程度的升高，在肠道aGVHD症状出现的最初2小时就观察到Th1、Th2细胞因子的改变趋势，并且在临床症状最严重的移植后28天各细胞因子的改变达到峰值，随着GVHD症状的控制(腹泻减轻)，这些改变逐渐恢复正常;唯有TGF-β从移植后第1周就开始下降，在产生GVHD症状的移植后21天降至谷值。例3未发生GVHD，移植后7天开始出现肺部感染，体温升高，造血恢复后体温下降，各细胞因子的表达在移植后7天有较明显的增高，移植后14天逐渐下降，与体温的变化一致。在移植排斥的例1，移植后1周时各细胞因子均有不同程度的升高，伴随植入比例的下降，细胞因子表达也逐渐降低，移植后60天检测各因子基本降至正常水平。例4第1次移植后植入比例逐渐下降，35天进行供者造血干细胞输注(DSI)，植入比例增加到85%，各细胞因子均在植入率较高的移植后14天达到峰值，随后随植入比例的下降而减低，DSI后随植入比例增高而增加。可见，移植后细胞因子的改变与植入率是相关的，移植后细胞因子迅速恢复到移植前水平很可能预示着移植排斥。例5逐渐由混合嵌合转化为完全嵌合，各细胞因子均有不同程度的升高。

　　GVHD中各细胞因子的表达不是单一改变，而是成网络性的统一变化。这可能是细胞因子风暴级联放大效应所导致。Min等[7]检测了52例异基因外周造血干细胞移植患者血清中IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α的表达，发现移植后1周IL-6水平的增加能够作为移植后并发症的早期预测指标，IL-6和IL-10的增高表达与移植后并发症(不一定是GVHD)相关。临床检测移植后患者的IL-6和IL-10水平，均肯定其在GVHD预测、发生和发展中有一定作用[8-14]。我们的结果发现，例2在aGVHD期间IL-6和IL-10高表达;例1移植后1周IL-6、IL-10升高表达，移植排斥后无病存活超过1年;例3各细胞因子的变化与体温的升高相关。因为我们的实验例数较少，未能观察到IL-6、IL-10与aGVHD的关系，也不能区分开炎症对这两个因子表达的影响。

　　实验发现，例2 在aGVHD时TGF-β的表达明显减低，而其余例中TGF-β的表达均增高，尤其是例3 TGF-β在移植后14天体温正常时增高，且变化幅度较为明显。通过对本实验5例移植中TGF-β变化的分析，我们推测它可能可以作为鉴别诊断aGVHD的有用指标之一。TGF-β不仅可以排除发热对细胞因子变化的影响，同时也可能作为临床上不易与其他腹泻相区分的肠道aGVHD的鉴别诊断指标。本实验的结果与文献报道相符[15]。

　　对于GVHD中细胞因子变化的研究也为其治疗提供了思路。应用封闭细胞因子或其受体的药物，以及抗细胞因子抗体都可以降低细胞因子的作用，减轻组织损伤。研究发现TNF在aGVHD的细胞因子级联“瀑布”式反应中起到关键的作用。TNF以及其家族成员通过上调Th1类细胞因子的表达影响aGVHD的肠道炎症反应 [16] 。在动物MHC完全不相合移植实验中发现阻断TNF/TNFR反应可以减轻肠道aGVHD [17]。Kobbe等[18]应用抗TNF单克隆抗体(infliximab)治疗4例大剂量激素治疗无效的重症aGVHD患者，3/4例患者症状明显缓解，2/4例患者治疗后存活超过200天。实验和临床研究均发现，抗TNF治疗对肠道GVHD比对其他器官GVHD更加有效[18-20]。

　　GVHD病理变化和细胞凋亡有很大联系，Fas-FasL参与了细胞凋亡的发生[21]。FasL可通过不依赖穿孔蛋白的杀伤作用诱导Fas+细胞凋亡，它在GVHD中很可能发挥了重要的作用，因此本研究也选择FasL进行检测。例2在肠道aGVHD期间FasL表达水平升高，伴随治疗药物的应用其表达水平逐渐下降，说明猕猴肠道aGVHD可以用药物控制，FasL mRNA表达的减低证明治疗有效。CSA、FK506可强烈抑制FasL的表达及其生物活性，从而抑制FasL诱导的T细胞激活，避免表达Fas同种异基因抗原的宿主细胞凋亡，从而控制GVHD。许多研究推测IFN-γ在启动aGVHD上起到重要的作用。IFN-γ可以诱导细胞高表达Fas，引起细胞的凋亡。Ellison等[22]应用TNF-γ基因敲除小鼠供者研究IFN-γ在C57BL/6--B6D2F1小鼠半相合移植后GVHD中的作用，发现应用IFN-γ基因敲除供者移植后依然产生GVHD，但是病程明显延长，出现类似慢性GVHD的症状，同时也发现Th2细胞因子表达增加。此研究结果提示在aGVHD时期调节IFN-γ的表达可以起到一定的治疗作用。

　　本研究应用猕猴单倍体相合NST模型检测细胞因子的动态变化在国内外均属首例。虽然半定量PCR的灵敏度及准确性较差，但是它的操作简单，成本较低，适合应用于较多的细胞因子初步研究中。本实验发现，移植猴细胞因子的表达变化与临床症状和植入情况联系密切。实验结果提示： TGF-β在aGVHD和无aGVHD动物中的表达存在显著差别，这一结果可以作为aGVHD的鉴别诊断指标，如区分普通腹泻与肠道aGVHD的腹泻，并且可以用于判断aGVHD时排除炎性发热对细胞因子表达变化的影响。但是，由于本实验研究动物例数较少，这一结果我们将在检测临床患者移植前后细胞因子的变化加以验证。

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