还原型谷胱甘肽抗白血病免疫佐剂作用实验研究

　　作者：潘敬新,林玲,郭健欣,朱元贵,蔡俊峰　　作者单位：福建医科大学第二附属医院血液科，泉州 362000;1福建医科大学附属协和医院血液科，福州 35000

　　【摘要】本研究探讨还原型谷胱甘肽(GSH)逆转反应性氧代谢物(ROM)对NK细胞抗白血病效应的抑制作用。在K562细胞、NK细胞的混合培养体系中分别加入富含单核细胞的单个核细胞(Mo)和白细胞介素-2(IL-2)，观察ROM产量和K562细胞抑制率，然后分别加入GSH或二氢氯化物组胺(组胺)，观察ROM产量及K562细胞抑制率的变化。结果表明：加入IL-2后，ROM的产量从33.17±25.02 U/L增至223.59±59.41 U/L(P<0.01)，K562细胞抑制率从65.56%升至85.89% (P<0.01);在加入E/Mo=10/1、10/5、10/10 3种浓度的Mo后，ROM产量分别为389.79±43.83 U/L，456.74±42.77 U/L，601.42±21.92 U/L，K562细胞抑制率分别为82.36%，81.36%，48.09%，加入组胺或GSH后，E/Mo=10/2时，ROM产量从389.79±43.83 U/L，分别减至50.21±22.4 U/L和-3.58±9.49 U/L(P<0.05)，随着GSH或组胺浓度的增加ROM产量逐减少，K562细胞抑制率从82.53%分别升至94.64%和96.39(P<0.05)，ROM产量与K562细胞抑制呈负相关(P<0.05);E/Mo=10/5或10/10时，高浓度的GSH或组胺可使ROM产量减少，但K562细胞抑制率提高不明显(P>0.05)。结论： 当E/Mo=10/2时，GSH逆转ROM强于组胺，提高NK细胞对K562的抑制率与组胺相似，但毒副作用轻微，GSH可能成为更理想的抗白血病的免疫佐剂。

　　【关键词】 白血病

　　Abstract To investigate the reversal effect of reduced glutathione(GSH) on suppression of NK cells by reactive oxygen metabolites (ROM) in K562 cells，interleukin-2 (IL-2) or mononuclear cell (Mo) was added in cultured cell line of K562 cells and NK cells，the yield of ROM and K562 cell suppression rate were observed.Then the histamine dihydrochloride (DHT) or GSH was added in the mixed cultured cell lines，the ROM production and K562 cell suppression rate were observed. The results showed that the ROM yield increased from 33.17±5.08 U/L to 223.59±9.41 U/L by IL-2，and K562 cell suppression rate increased from 65.56% to 85.89% by IL-2 (P<0.01).The ROM yields were 389.79±43.83 U/ml， 456.74±42.77 U/ml and 601.42±21.92 U/ml respectively，and K562 cell suppression rates were 82.36%， 81.36% and 48.09% respectively，when Mo was added in the mixed cultured cell lines under ratios of E/Mo being 10/2，10/5 and 10/10.When E/Mo was 10/2，DHT or GSH was added in the mixed cultured cell line ROM yield decreased from 389.79±3.83 U/L to 50.21±2.4 U/L or-3.58±9.49 U/L (P<0.05) respectively.With increase of concentration of DHT or GSH，the ROM yield in the mixed cultured cell line decreased (P<0.05)，the K562 cell suppression rate increased from 82.53% to 94.64% or 96.39% (P<0.05)，the more ROM yield，the less K562 suppression rate (P<0.05).When E/Mo is 10/5 or 10/10，the ROM yield decreased by the high concentration of DHT or GSH (P<0.05)，but the K562 cell suppression rate not increased by every concentration of DHT or GSH.GSH was as effective as DHT in the reversing ROM and increasing K562 cell suppression rate.It is concluded that GSH may reverse ROM and increase K562 cell suppression rate，and GSH is as effective as DHT，but GSH has less side-effect than DHT.Therefore，GSH would be better antileukemia immune adjuvant.

　　Key words glutathione; leukemia; immune adjuvant; reactive oxygen metabolite; NK cell

　　人们很早就发现，肿瘤组织内及其周围存在着大量T/NK细胞。与机体其他部位相比，肿瘤及其周围组织中的T/NK细胞功能显著降低[1]。当今，常以T/NK细胞为效应细胞，以IL-2为刺激剂作为肿瘤的过继性免疫治疗的手段，但对大部分病人疗效不佳，其原因是肿瘤及其周围组织内也存在大量富含单核/巨噬细胞的单个核细胞 (Mo)。 Mo 对荷瘤动物淋巴细胞抗肿瘤作用有抑制效应，这种抑制作用与Mo分泌反应性氧代谢物(reactive oxygen metabolites，ROM)密切相关[2]。二氢氯化物组胺(简称组胺)可以逆转ROM对T/NK抗肿瘤活性抑制作用，并且已做II期临床试验，效果明显[1]，但其毒副作用大，临床难于应用。为了寻求高效低毒、便于临床应用的ROM逆转剂，我们进行了还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)在体外白血病细胞株培养体系中逆转ROM、增强NK细胞杀伤K562细胞的实验研究，现将结果报道如下。

　　材料和方法

　　材料

　　K562细胞株由福建医科大学附属协和医院老年病研究所朱元贵博士惠赠，新鲜健康人单的采白细胞由泉州市中心血站提供，IL-2为北京双鹭药业公司产品，二氢氯化物组胺、GSH和MTT均为Sigma公司产品，CD3、CD56免疫组织化学试剂盒为北京中山公司产品，活性氧测试剂盒为南京建成公司产品。

　　方法

　　富含NK细胞的单个核细胞(E)的分离 采用Percoll不连续密度梯度分离法[2]分离，采用免疫组织化学法进行鉴定[3]，其纯度达30%，活存率≥95%。

　　富含单核细胞的单个核细胞(Mo)的分离 采用Colotta方法[2]分离并作非特异性酯酶染色鉴定纯度，4℃冷藏备用，其纯度为70%，活存率≥95%。

　　细胞培养及检测

　　将富含NK细胞的单个核细胞(E)、K562细胞(T)按E/T比10∶1、10∶5、10∶10 3个比例加入相应的96孔培养板中(NK细胞为105/孔)，肿瘤组织中淋巴细胞与单核细胞的比例在文献中未见报道，我们观察30份恶性肿瘤的病理切片及慢性髓细胞白血病的骨髓涂片，其比例多数在10∶1至10∶3，少数高达10∶10，因此，在E/T为10∶1的比例孔中按E/Mo细胞为10∶2、10∶5、10∶10比例添加单核细胞，以仅加K562细胞、NK细胞、Mo、NK细胞+Mo、Mo+K562细胞及不加任何细胞的全空白作为对照，混合培养6小时检测ROM产量，同时在24小时用MTT法[4]检测K562细胞抑制率(K562 cell inhibition rate，KIR)，计算公式为KIR=(1-ODE/T-DDE/ODT)×100%。每组每种检测各作3个复孔，观察ROM产量与KIR、NK细胞数量、Mo数量之间的关系。

　　GSH作用的测定

　　以二氢氯化物组胺为阳性对照，以K562+NK+Mo+IL-2为空白对照，检测GSH逆转ROM及提高K562细胞抑制率的作用。按上述细胞比例先分别入NK细胞、单核细胞、IL-2(150 U/ml) (方法根据文献[5] )，同时在各个比例孔中分别加组胺(10、20和50 umol/L 3种浓度)，GSH(25、50、100和250 μmol/L 4种浓度)，在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下共培养24小时后加入K562细胞(按E/T比为10/1)，再培养6小时及24小时，检测ROM产量，同时用MTT法检测K562细胞抑制率，KIR=(1-ODE/T-ODE/ODT)×100%;同样每组每种检测各做3个复孔[4]。

　　ROM检测

　　采用紫外分光光度比色法、按南京建成活性氧测试盒说明操作，检测活性氧的产量。

　　K562细胞抑制率 采用MTT法检测(公式见上)。

　　统计学分析

　　采用SPSS 11.0统计软件进行统计分析。计量资料结果以x±SD表示，多组均数比较采用广义线性模型(general linear model)，各实验组均数间多重比较采用LSD-t检验(方差齐)或Dunnett T3检验(方差不齐时)，双变量相关分析采用Pearson相关分析。以P<0.05 作为差异显著性检验水平。

　　结 果

　　GSH对ROM产量及NK细胞抑制K562的影响

　　当E/Mo=10/2时，各种浓度GSH和组胺均可明显降低ROM产量，提高K562细胞抑制率(P<0.05)，逆转ROM作用GSH强于组胺;当E/Mo=10/5时，各浓度组胺和高浓度GSH可减少ROM产量(P<0.05)，但不能提高K562细胞抑制率;当E/Mo=10/10，仅高浓度的组胺和高浓度GSH可减少ROM产量(P<0.05)，各种浓度的组胺和GSH均不能提高K562细胞抑制率(P>0.05)(表1)。Table 1.Effect of GSH on ROM yield and NK cell inhibition on K562 cells (略)

　　NK细胞、Mo、IL-2对ROM产量和K562细胞抑制率的影响

　　结果显示：K562细胞加入NK细胞后，ROM产量减少(P<0.05)，K562细胞抑制率达65.50%，而加入Mo后ROM产量明显增加，且Mo浓度越高，ROM产量越多，呈量效关系(P<0.05)，但K562细胞不被抑制(P>0.05);加入激活剂IL-2后，K562细胞+NK细胞混合培养体系中ROM产量明显增多(P<0.05)，K562细胞的抑制率明显提高(P<0.05);

　　在K562+NK+IL-2培养体系中加入Mo，ROM产量增多，且Mo浓度越高，ROM产量越多，E/Mo=10/1或E/Mo=10/5，K562细胞抑制率改变不明显，当E/Mo=10/10时，K562细胞抑制率从86.5%降至48.09%(P<0.01)(表2) 。Table 2. Effect of NK cells and/or monocytes on ROM yield and K562 cell inhibiton rate(略)

　　ROM产量与K562细胞抑制的关系

　　ROM的产量与K562细胞的抑制率呈负相关(r=-0.56，P<0.05)，ROM产量越高、K562细胞的抑制率越低。随着Mo浓度的升高，ROM的产量增多，K562细胞的抑制率逐降低，且呈量效关系(P<0.05)。

　　讨论

　　近年来发现，ROM与肿瘤的发生、发展及抗肿瘤(白血病)免疫的关系十分密切，Mo产生的ROM是通过下调T/NK细胞的一种重要信号传导分子——CD3表达，而抑制T/NK细胞增殖和NK细胞的抗肿瘤细胞毒作用[6]。本研究发现，K562细胞培养体系中加入NK细胞后，ROM的产生率减少，K562细胞的抑制率为65.56%;加入Mo后ROM产量增多，K562细胞的抑制率为7.6%，两者差异十分明显;而加入IL-2后，ROM产量明显增多，K562细胞的抑制率：K562+NK+IL-2者高达85.89%，而K562+Mo+IL-2者仅17.18%，两者差异也十分明显。上述结果充分说明ROM主要是由Mo产生，而抑制K562细胞主要是NK细胞。在没有Mo存在的情况下，IL-2可显著提高NK细胞对K562细胞的抑制效应，抑制率从65.56%提高至85.89%。当K562+NK和K562+NK+IL-2培养体系中分别加入E/Mo=10∶1，10∶5，10∶10的Mo细胞后，随着Mo细胞数量的增加，ROM的产量逐增多，K562细胞被抑制率逐降低，呈现一定量效关系，Mo数量与ROM产量呈正相关，而与K562细胞的抑制率呈负相关。现已证实在恶性肿瘤及其周围组织内部可见大量Mo。这就可解释为什么当今采用T/NK细胞作为效应细胞，IL-2作为激活剂的过继性肿瘤(白血病)的免疫治疗方案有效率低。

　　在K562+NK+IL-2培养体系中，加入低浓度的Mo后，ROM的产量增多，K562细胞的抑制率降低，但这种现象可被GSH或组胺所阻断，且随GSH和组胺药物浓度增加，ROM产量逐渐少(P<0.05)，但K562细胞的抑制率未见相应提高(P>0.05)。 国外学者认为，组胺是IL-2治疗的理想免疫佐剂，其通过H2受体作用拮抗ROM对T/NK细胞的抑制作用。Hellstrand等[7]发现，微摩尔浓度的过氧化氢(H2O2)即可重建单核细胞对NK细胞的抑制效应，应用组胺后，H2O2产量减少，ROM对NK细胞的抑制作用被中止。Asea等[8]的研究发现，Mo来源的ROM可下调IL-2诱导的NK细胞的γ-IFN mRNA的表达，而组胺可有效地逆转这种作用。但也有II期临床试验发现相反的结果，Donskov等[9]联用组胺、IL-2、α-干扰素治疗肾脏系膜细胞癌时，组胺提高疗效不显著(P>0.05)，此外，组胺具有诱导或加重消化性溃疡、扩张血管、诱发或加重支气管哮喘等一系列严重毒副作用，其临床应用受到限制。GSH为γ-谷氨酸-半胱氨酸-甘氨酸构成的三肽，其分子结构上含有非蛋白巯基，GSH通过自身或经谷胱甘肽转移酶系统(GST-S)催化过氧化氢和过氧化脂质等使ROM转化，发挥其药理作用。因此，当E/Mo=10/2时，其对ROM的逆转作用强于组胺。

　　近年来研究发现，肿瘤/白血病细胞内GSH/GST-S活性增高使肿瘤/白血病细胞产生多药耐药性[10，11]，细胞内的GSH增多，降低了化疗效果。GSH是肿瘤/白血病多源耐药的机制之一，我们得出了与文献报道相反的结果的原因是：文献报道GSH影响肿瘤/白血病疗效指的是化疗疗效，因为许多化疗药物进入细胞内主要通过产生ROM而发挥作用，在ROM作用下线粒体还原型巯基转化为氧化型二硫键，使线粒体通透性转换孔(mtPTP)开放，并进一步诱导细胞凋亡[12]。因此，肿瘤/白血病细胞内GSH增多，化疗药效降低;而在过继性免疫治疗中，GSH在肿瘤/白血病细胞外起到逆转Mo产生的ROM，保护T/NK细胞免受ROM的损伤，充分发挥T/NK细胞的抗肿瘤作用。

　　综上所述，GSH具有逆转ROM，提高NK对肿瘤/白血病细胞的抑制活性，毒副作用轻微，可能成为继组胺之后更理想抗肿瘤/白血病免疫佐剂，值得进一步研究。

　　【参考文献】

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　　12 Kroemer G，de-The H. Arsenic trioxide，a novel mitochondriatoxic anticancer agent，J Nat Cancer Inst，1999; 91: 743-745Table 2.Eeffect of GSH on ROM production and K562 cell inhibition rate (NK/K562=10/1)