NKG2D及其配体RAE1、H60在移植物抗肿瘤中的作用

　　作者：李晓峰　　作者单位：福建省泉州市中医院肿瘤科，泉州 362000

　　【摘要】为探讨NKG2D及其配体RAE1、H60在单倍体相合(haploidentical)造血干细胞移植介导的移植物抗肿瘤效应中的作用，以皮下接种H22细胞的BABL/c×C57BL/6杂交F1代(CB6F1)小鼠为受鼠，以C57BL/6小鼠的骨髓+脾细胞为供者细胞，分别用抗CD90.2、NK1.1和NKG2D单克隆抗体清除供者T细胞、NK细胞和封闭NKG2D受体，进行单倍体相合细胞移植，观察移植后的抗肿瘤效应，并以半定量RTPCR法检测移植后小鼠肿瘤组织RAE1、H60的mRNA表达水平。结果发现：清除供者T细胞、NK细胞和封闭NKG2D的移植均导致移植物抗肿瘤效应的下降，MHC单倍体相合细胞移植后肿瘤细胞RAE1、H60的mRNA表达水平上升。结论：NKG2D及其配体RAE1、H60在移植物抗肿瘤效应中的起着重要的作用。

　　【关键词】 NKG2D RAE1 H60,移植物抗肿瘤效应

　　Abstract The study was purposed to explore the effects of NKG2D receptor and its ligands RAE1 and H60 on graftversustumor (GVT) response induced by MHC haploidentical bone marrow/spleen cell transplantation. Female (BALB/c×C57BL/6) F1 mice ( CB6F1，H2Kb/d) inoculated with H22 cells to develop a solid tumor model were the recipients, and bone marrow mixed with spleen cells of the healthy male C57BL/6(H2Kb) mice were the donor cells. GVT response was observed after transplantation that from donor cells T and NK cells were purged with antiCD3 and antiNK monoclonal antibody, and the NKG2D receptor was blocked with antiNKG2D monoclonal antibody, the expression levels of RAE1 and H60 mRNA in tumor tissue were measured by means of semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) at different time points after transplantation. The results showed that the GVT response of transplantation was reduced after in vitro depletion of T and NK cells or blocking NKG2D receptor in donor cells of the graft, the expression levels of RAE1 and H60 mRNA in tumor tissue increased after transplantation of haploidential bone marrow mixed with spleen cells. It is concluded that NKG2D and its ligands RAE1 and H60 may play important roles in GVT response.

　　Key words NKG2D; RAE1; H60; Graftversustumor response

　　J Exp Hematol 2007; 15(1):160-164

　　异基因造血干细胞移植(AlloHSCT)以及移植后的供者淋巴细胞输注(DLI)可产生移植物抗肿瘤(GVT)效应，虽然其抗肿瘤的机制尚不明确，但已成为一种免疫治疗手段并在一些血液肿瘤和实体瘤中得到应用[1]。C57BL/6→CB6F1方向的移植是一个常用的MHC单倍体相合移植动物模型[2，3]，我们利用BABL/c来源的H22细胞接种到CB6F1小鼠的皮下形成实体瘤，发现荷瘤小鼠经环磷酰胺腹腔化疗后，输注经60Co照射的C57BL/6骨髓+脾细胞可出现嵌合体，且可减轻移植物抗宿主病(GVHD)而保留GVT作用[4]。本研究对供者细胞的NKG2D及其配体RAE1、H60在GVT效应中的作用进行初步的探讨。

　　材料和方法

　　实验动物和细胞

　　清洁级近交系小鼠BABL/c(H2Kd，♀)、C57BL/6 (H2Kb，♂)、清洁级近交系杂交小鼠CB6F1(BALB/c×C57BL/6的杂交子一代，H2Kd/b，♀)，均6-8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)20020003。BABL/c来源的小鼠肝癌H22细胞株，购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心，CCTCC编号：GDC091)。

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(1)NKG2D及其配体RAE1、H60在移植物抗肿瘤中的作用

　　主要仪器和试剂

　　PTC100 PCR扩增仪为MJ Research INC公司产品。FACSCalibur流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品。T1000型60Co治疗机为加拿大产品。JeDa801凝胶分析系统，购自江苏捷达科技公司。RNA抽提(TRI Reagent Becton Dickinson产品)试剂盒，购自晶美公司。RTPCR一步法试剂盒购自Invitrogen公司。PE标记的小鼠CD3、NK(CD49 b/panNK cells)和纯化的小鼠CD90.2、NK1.1单克隆抗体为Becton Dickinson公司产品。纯化及PE标记的小鼠NKG2D单克隆抗体为Biolegend公司产品。注射用环磷酰胺(CTX)，购自上海华联制药有限公司(批号：040801)。小鼠RAE1、H60及内参GAPDH引物，由上海博亚生物技术有限公司合成。

　　供者骨髓+脾细胞的制备

　　细胞制备 无菌取C57BL/6小鼠股骨、胫骨以及脾脏，制备成骨髓和脾细胞悬液，用无血清RPMI 1640培养液将骨髓、脾细胞调整成浓度为6.7×107/ml、2×108/m1，将骨髓与脾细胞等体积(1∶1比例)混合，分成4份，1份以60Co照射，另3份分别用CD90.2、NK1.1单克隆抗体清除T细胞、NK细胞和用NKG2D单克隆抗体封闭NKG2D受体后再照射60Co。

　　清除方法 每1ml脾细胞+骨髓混合细胞中分别加入CD90.2、NK1.1单克隆抗体1 ml(原液1∶200稀释，含2.5 μg的纯化单克隆抗体)，冰水浴30分钟，用PBS洗2次，加入新鲜兔血清1 ml重悬，37℃水浴箱中作用45分钟，离心后收集沉淀细胞，再用PBS液洗涤2次，用无血清RPMI 1640培养液调至原体积。

　　封闭过程 每1 ml脾细胞+骨髓混合细胞中加入NKG2D单克隆抗体1 ml(原液1∶200稀释，含2.5 μg的纯化NKG2D单克隆抗体)，冰水浴30分钟，用PBS洗2次，收集沉淀用无血清RPMI 1640培养液调至原体积。用流式细胞仪检测细胞清除和受体封闭效果。60Co照射剂量为7.5 Gy，照射时间11.39分钟，剂量率0.6585 Gy/min。

　　动物造模和分组

　　H22细胞培养3天后，调整细胞浓度为1×107/ml，取0.2 ml注入BABL/c小鼠腹腔，7天后抽取腹水，用生理盐水(NS)配制成1×107/ml瘤细胞悬液，以0.2毫升(2×106个H22细胞)/只，接种到CB6F1小鼠右腋皮下。接种肿瘤细胞后第3天开始进行预处理，方案为CTX腹腔化疗，每只小鼠的注射剂量为80 mg/(kg•d)，连用4天。预处理结束后第3、5、7天从尾靜脉注入无血清RPMI 1640培养液 (对照组)、60Co照射后的C57BL/6供者细胞(实验组)、清除T细胞的供者细胞(清除T细胞组)、清除NK细胞的供者细胞(清除NK细胞组)及封闭NKG2D的供者细胞(封闭NKG2D组)，300微升/次，每组6只小鼠。尾靜脉注射结束后第18天处死全部小鼠，取瘤称重，并计算抑瘤率，

　　抑瘤率=[(对照组瘤重-其他组瘤重)/对照组瘤重]×100%

　　另有21只的处理方式与实验组相同的小鼠(检测鼠)，作为检测RAE1、H60 mRNA等指标用。

　　小鼠肿瘤组织的RAE1、H60 mRNA表达的半定量RTPCR检测

　　取单倍体相合细胞移植后第3、7、14、18天检测小鼠各4只，剥取肿瘤组织，按试剂盒说明书抽提肿瘤细胞总RNA。

　　引物设计 查阅GenBank，应用Primer 5软件设计引物。RAE1β上游引物：5′CCCACATTTACAA GTCACCA3′;下游引物：5′AAGTAGAGTGGC TGGGAGGT3′ ，产物长度334 bp。H60上游引物：5′ATGGAGCAGTGGAAGAACAA3′;下游引物：5′CAGCATACACCAAGCGAATA3′，产物长度290 bp。内参GAPDH上游引物：5′ACCACAGTC CATGCCATCAC3′;下游引物：5′TCCACCACCC TGTTGCTGTA3′，产物长度452 bp。

　　RAE1β RTPCR反应 总反应体积25 μl，其中2×Reaction Mix 12.5 μl，RT/ Platinum Taq Mix 0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，RNA 1 μl，DEPC水10 μl。反应条件为50℃ 30分钟，94℃预变性 5分钟 ，然后94℃30秒 、50℃ 30秒、 72℃ 30秒，38个循环，内参GAPDH条件同RAE1β。

　　H60逆转录和PCR扩增 逆转录体系中Mg2+ 4 μl，10×buffer 2 μl，dNTP 2 μl，RNasin 0.5 μl，AMV 1 μl，OligodT 1 μl，RNA 2.5 μl，H2O 7 μl，逆转录温度为45度。用逆转录cDNA作PCR扩增，25 μl反应体系中内含10×buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，Taq酶0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，模板2 μl，H2O 18.5 μl。退火温度为53℃，共38个循环，内参GAPDH条件同H60。

　　电泳分析 取PCR产物16 μl进行凝胶电泳，用凝胶分析系统测定各条带灰度值，计算RAE1和H60的mRNA的相对表达量，计算公式：

　　相对量=(目的产物电泳条带灰度值/

　　GAPDH产物电泳条灰度值)×100%

　　统计学处理

　　结果用(±SD)表示，用SPSS 11.5软件处理，显著性检验采用单因素方差分析。

　　结 果

　　供者T细胞和NK细胞的清除及NKG2D受体的封闭效果

　　从表1可见：清除前的CD3细胞阳性率为(54.76±7.49%)，清除后为(0.30±0.26)%，表明供者T细胞已基本被清除; NK细胞阳性率从(15.34±5.32)%下降到(1.29±1.73)%，这表明NK细胞大部分被清除;NKG2D受体从封闭前的(8.12±2.17)%下降到封闭后的(0.30±0.12)%，这表明NKG2D受体已被充分封闭。

　　不同成分单倍体相合细胞输注的抗肿瘤效应

　　60Co照射后的C57BL/6供者细胞移植组(实验组)的肿瘤重量平均为0.27 g，明显小于对照组(1.30 g)，差异有显著的统计学意义(P<0.01)，说明单倍体相合细胞移植具有抗肿瘤效应。而清除供者细胞中的T细胞、NK细胞及封闭供者细胞的NKG2D受体之后，平均瘤重分别为1.08 g、0.72 g和1.39 g，抗肿瘤的效应就明显下降了，虽然清除供者NK细胞的移植仍存不明显的抑制肿瘤作用(抑瘤率44.6%)，与对照组比较，差异没有统计学意义(P>0.05)(表2)。

　　单倍体相合细胞移植后肿瘤组织RAE1、H60 mRNA表达变化情况

　　RAE1和H60 mRNA表达的半定量分析结果显示：单倍体相合骨髓+脾细胞移植后第3天，肿瘤细胞RAE1 mRNA 的相对表达量为(24.30±4.32)%，第7、14、18天表达逐步升高，差异具有显著统计学意义(F=79.131，P<0.01);而H60 mRNA水平在移植后第3天为(7.03±9.55)%，第7天升高为(26.34±5.76)%，此后维持在这个水平之上，其表达水平的比较也有显著性差异(F=8.698，P<0.01)(表3)。RAE1、H60 mRNA的RTPCR电泳条带见附图。

　　研究表明，机体的抗肿瘤免疫主要是由细胞免疫介导的，其中主要的效应细胞是T细胞和NK细胞。由于肿瘤细胞来源于患者本身，其抗原往往不能活化自身的T细胞(已被阴性选择)，加上肿瘤细胞往往MHCI类分子缺陷或低表达，且一般不表达激活T细胞所需的第二信号，从而逃避T细胞的攻击;同时，肿瘤细胞在丢失或变异MHCⅠ类抗原的同时可高表达非经典MHCⅠ类分子(如HLAG、HLAE)，传递强烈的杀伤抑制信号,致使NK细胞不能活化，造成免疫耐受。GVT效应是通过供者细胞介导的[5]，一些研究揭示：去除供者T细胞的移植可使GVHD反应下降但肿瘤复发率上升，说明供者T细胞在GVT反应中起重要的作用[6,7];而供受者间杀伤抑制性受体(KIR)的显著差异影响移植后受者免疫功能的重建和免疫应答水平，从而显著地改变移植的临床转归，说明NK细胞在GVT反应中也起着重要的作用[8]。本研究的T细胞和NK细胞清除实验结果也证实T细胞和NK细胞都是GVT作用的主要效应细胞。本研究还显示：清除供者NK细胞的移植仍有一定的GVT效应(抑瘤率44.6%)，提示供者T细胞可能是最重要的效应细胞。这是由于供者T细胞与肿瘤细胞的MHC存在差异，供者细胞植入后可以产生针对肿瘤抗原的特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)，但活化CTL所需的第二信号由谁提供呢?清除T细胞和NK细胞的移植都会使GVT效应下降，说明充分的GVT效应需要有供者T细胞和NK细胞的共同参与，但二者是怎样协同的呢?

　　关于这两个问题，从本研究的NKG2D封闭实验及其配体RAE1、H60 mRNA在移植后的表达情况可以得到一些线索。NKG2D受体是NK细胞识别靶细胞的一种主要结构，不仅表达于所有的NK细胞，还在NKT、CD8+αβT细胞、活化的巨噬细胞和肿瘤浸润的Vδ1 γδT细胞上表达[9，10]。NKG2D与其配体接触后可激活NK细胞的细胞毒活性，并为抗原特异性CTL提供共刺激信号，从而使效应细胞活化[11]。研究表明，NK细胞和一些CD8+T细胞能够消除高度表达NKG2D配体的肿瘤细胞，并在小鼠肿瘤模型中激发起针对该肿瘤细胞系的抗肿瘤免疫应答[12]。体外研究证实，抗NKG2D抗体可抑制NK和LAK细胞的细胞毒效应[13]。本研究显示，用抗体封闭供者细胞的NKG2D受体，GVT效应没有出现，提示NKG2D受体在移植免疫中可能是T细胞和NK细胞等效应细胞识别和杀伤肿瘤的关键因素之一。

　　NKG2D的配体在多数正常细胞和组织中不表达，但在感染及应激刺激下诱导表达，并在许多肿瘤细胞上表达。RAE1和H60是研究较多的小鼠NKG2D配体，在许多小鼠肿瘤中可检测到[14]，与人类的NKG2D配体MICA、MICB相似，可在环境压力(热休克、紫外线、病毒感染、恶性转化和致癌物质等方式)作用下使靶细胞低表达，也可在压力诱导下使肿瘤细胞高表达，其中NKG2D与RAE1β、H60的亲和力分别是KIR与其配体亲和力的数十倍、数百倍[15]。本研究用半定量RTPCR法对移植后小鼠肿瘤组织的RAE1和H60的mRNA表达进行持续检测发现，小鼠H22肿瘤细胞RAE1 mRNA的表达在移植后有进行性增高的趋势，H60的mRNA在单倍体相合细胞移植后的表达也迅速增加。作为NKG2D的配体，肿瘤细胞上RAE1和H60在移植后表达的增加，可激活带有NKG2D受体的NK细胞和T细胞，使效应细胞对靶细胞进行杀伤。

　　虽然单凭本研究远远不能明确肿瘤异基因免疫治疗的机制，但实验结果提示：NKG2D及其配体RAE1、H60在GVT效应中起着重要的作用，值得进一步证实和研究。

　　【参考文献】

　　1 李晓峰，叶德富，陈强.肿瘤的异基因免疫治疗研究现状.福建医科大学学报, 2005;39(增刊)：64-66

　　2段连宁，郭坤元，褚建新等.小鼠红白血病在半相合型小鼠体内的生物特性. 中国实验血液学杂志, 2002;10：208-221

　　3李俭杰，张毅，张明伟等.小鼠H2半相合非清髓同种异基因造血干细胞移植模型的建立及其相关研究. 中国实验血液学杂志, 2004;12：655-660

　　4陈强，李晓峰，叶韵斌等.MHC半相合脾加骨髓细胞诱发H22荷瘤鼠的抗肿瘤效应.中国肿瘤生物治疗杂志，.2006; 13： 107-111

　　5G.施蒂勒，P.瓦尔德(朱立平，张伟主译). 癌症免疫治疗. 北京：化学工业出版社，2004：279-289

　　6Renga M, Pedrazzoli P, Siena S. Present results and perspectives of allogeneic nonmyeloablative hematopoietic stem cell transplantation for treatment of human solid tumors. Ann Oncol, 2003;14：1177-1184

　　7Storb RF, Lucarelli G, McSweeney PA, et al. Hematopoietic cell transplantation for benign hematological disorders and solid tumors. Hematology. Am Soc Hematol Educ Program, 2003：372-397

　　8Ruggeri L, Capanni M, Urbani E, et al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science, 2002;295(5562)：2097-2100

　　9Groh V, Rhinehart R, Secrist H, et al. Broad tumorassociated expression and recognition by tumorderived gamma delta T cells of MICA and MICB. Proc Natl Acad Sci USA, 1999; 96：6879-6884

　　10Vivier E, Tomasello E, Paul P. Lymphocyte activation via NKG2D: towards a new paradigm in immune recognition. Curr Opin Immunol, 2002;14：306-311

　　11Diefenbach A, Tomasello E, Lucas M, et al. Selective associations with signaling proteins determine stimulatory versus costimulatory activity of NKG2D. Nat Immunol, 2002;3：1142-1149

　　12Diefenbach A, Jensen ER, Jamieson AM, et al. Rae1 and H60 ligands of the NKG2D receptor stimulate tumour immunity. Nature, 2001;413(6852)：165-171

　　13刘映霞，胡国龄，刘敏等.抗NKG2D多克隆抗体抑制NK和LAK细胞细胞毒效应的研究. 细胞与分子免疫学杂志, 2003;19：257-259

　　14Cerwenka A, Bakker AB, McClanahan T, et al. Retinoic acid early inducible genes define a ligand family for the activating NKG2D receptor in mice. Immunity, 2000; 12：721-727

　　15O′ Callaghan CA, Cerwenka A, Willcox BE, et al. Molecular competition for NKG2D: H60 and RAE1 compete unequally for NKG2D with dominance of H60. Immunity, 2001;15：201-211