基因、信号调控异常与再生障碍性贫血的发病及治疗

　　作者：刘红　　作者单位：南通大学附属医院血液科， 南通

　　【关键词】 再生障碍性贫血;基因;信号调控

　　再生障碍性贫血(AA)是一组由多种原因，通过不同机制引起的异质性疾病，最终均存在骨髓造血干/祖细胞缺乏。造成造血细胞减少的机制比较复杂，临床和实验数据均支持免疫异常在AA发病中的作用，但其具体的发病机理尚不清楚。本文就近年基因、信号调控异常与再生障碍性贫血造血细胞凋亡增加及其发病方面的研究及治疗进展作一简述。

　　1 发病机理

　　1.1 造血细胞凋亡增加 AA患者骨髓细胞凋亡增加已被不少研究所证实。Callera等用原位缺口末端标记法(TUNEL)检测了11例AA(含重型AA4例)的骨髓活检标本，发现其骨髓细胞凋亡率(8.19%±1.45%)明显高于正常对照组(2.07%±0.86%)[1]。同一学者还发现AA骨髓和外周血淋巴细胞对抗Fas抗体诱导的凋亡敏感性增加，而在恢复期AA患者、正常人及多次输血的非AA患者未发现这种现象，提示凋亡增加不仅发生于造血前体细胞，而且是一个从造血前体细胞到成熟血细胞的连续性事件。Philpott等采用7-AAD(7-氨基放线菌素D)和抗CD34抗体双标法在流式细胞仪上检测了46例AA患者(含重型AA12例)骨髓CD34+细胞的凋亡率，发现：(1)AA患者骨髓CD34+细胞的凋亡率(33.44%±9.26%)明显高于对照组(7.86%±0.79%);(2)骨髓中CD34+细胞绝对值最少的患者，其CD34+细胞的凋亡率最高;(3)骨髓CD34+细胞的凋亡率与患者输血依赖性相关。因而认为AA患者骨髓造血干细胞缺乏是由于过度凋亡所致[2]。我们研究发现，将23例AA患者(含重型AA10例)血清同正常人骨髓CD34+细胞共同孵育后，能促使正常人CD34+细胞凋亡，重型AA组血清诱导的CD34+细胞凋亡率明显高于非重型AA组和正常对照组，非重型AA组血清诱导CD34+细胞凋亡率高于对照组，且CD34+细胞凋亡率与AA患者的外周血白细胞数呈负相关。也进一步提示凋亡加速是AA患者造血干/祖细胞缺乏的重要原因[3]。

　　1.2 凋亡相关基因及激酶的异常

　　1.2.1 Fas/FasL系统 Fas基因编码的Fas(Apo-1/CD95)是一种分子量为45 kD的Ⅰ类跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)或神经生长因子(NGFR)受体超家族成员。Fas配体(FasL)是一种分子量为40 kD，属于TNF家族成员的Ⅱ类膜蛋白。已知Fas和其配体或抗Fas单克隆抗体之间可以发生交联，介导细胞凋亡信号，构成一条重要的细胞凋亡诱导途径。有关Fas/FasL系统参与AA造血细胞凋亡增加机制的研究已有不少报道。Maciejewski等采用免疫荧光双标法检测了41例AA患者及40例正常志愿者骨髓中CD34+细胞膜上Fas抗原(CD95)的表达情况，结果发现AA患者骨髓CD34+细胞膜上Fas抗原表达量比正常人明显增高，恢复期的AA患者骨髓CD34+细胞膜上Fas抗原表达量有所下降，但仍高于正常对照组，同时发现Fas抗原的表达量同由抗Fas抗体诱导的集落形成抑制活性有相关性，因此推断Fas/FasL系统参与了AA骨髓造血功能障碍的病理生理过程[4]。Callera 等还发现重型AA患者淋巴细胞Fas抗原表达量也高于对照组。提示Fas/FasL系统不仅参与了AA造血干/祖细胞的凋亡，而且还可能介导了AA患者成熟淋巴细胞的凋亡。我们研究发现AA患者血清可诱导CD34+细胞表达Fas抗原，且AA患者血清诱导的凋亡细胞数与AA患者血清诱导的CD34+细胞表面的Fas抗原表达呈正相关，提示AA血清诱导正常骨髓CD34+细胞凋亡增加也与 Fas/FasL系统有关[3]。

　　1.2.2 Bcl-2基因及相关基因 Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)蛋白大家族是调节细胞凋亡的关键元件， 该家族成员中主要包括了Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、CED-9等凋亡抑制基因和Bcl-XS、Bax、Bad、Bak等凋亡促进基因，家族成员之间可相互影响，或与其它凋亡调控基因(如P53、c-MYC等)相互影响，共同组成一个复杂的凋亡调控系统。有关Bcl-2及相关基因在AA造血细胞凋亡增加的病理过程中的作用尚有争论。Callera等研究认为，由Fas介导的AA患者骨髓及外周血T、B淋巴细胞的凋亡没有Bcl-2的参与，原因是Fas介导的骨髓CD34+细胞凋亡绕开了Bcl-2及Bcl-X的抗凋亡效应[5]。而张圣明等却发现AA患者骨髓CD34+细胞Bcl-2蛋白的表达量明显低于正常人，作者认为某些致病因子引起造血干/祖细胞的抑凋亡基因表达减少，致使造血细胞凋亡相对增多，从而发生AA[6]。

　　1.2.3 早幼粒细胞白血病(PML)基因 该基因定位于15号染色体，其编码的PML蛋白属于一类新型的核蛋白家族，正常情况下定位于一种被称为核体(NBs)或PML致癌结构(POD)的核内亚微结构中，具有抑制肿瘤、生长、诱导凋亡等作用，在Fas、IFN和TNF诱导的细胞凋亡中起了关键作用。我们研究发现，AA患者血清在促使正常人外周血淋巴细胞及CD34+细胞凋亡的同时还能上调造血细胞PML蛋白的表达，且细胞凋亡的增加与其PML蛋白表达增加之间正相关，提示PML蛋白的高表达与造血细胞凋亡密切相关。进一步研究显示， caspase8 抑制剂可部分阻断再障患者血清的这种作用，但caspase3 抑制剂不能阻断这种作用，提示caspase8可能参与了这一过程[7]。

　　1.2.4 丝/苏氨酸蛋白激酶Akt 又名蛋白激酶B(PKB),它在调节细胞生存及凋亡中起关键作用。我们的研究显示再障患者血清作用后pAkt表达减少，提示Akt信号通路异常可能与再障患者造血细胞过度凋亡有关。为进一步阐明负性调控Akt信号传导的途径，我们以32D细胞，一种正常鼠骨髓细胞为靶细胞，观察不同的PKC抑制剂对32D细胞pAkt表达的影响。结果显示PKC抑制剂GF109203X,一种可同时抑制cPKC及nPKC的抑制物，可解除PMA对AKT活化的抑制作用。R031-8820，一种 PKCε特异性抑制物也可阻断PMA对 AKT活化的抑制作用，而 PKCδ特异性抑制物Rottlerin及PKCα/βⅠ特异性抑制物G?觟6976则不能阻断PMA 对AKT活化的抑制作用。质粒转导法研究则进一步显示32D细胞过度表达野生型及持续突变型PKCε，可明显抑制AKT的活化，同时这种细胞在G-CSF刺激下的增殖及生存也明显受抑。提示PKCε可负性调节AKT活化，从而抑制细胞的增殖和生存[8]。

　　1.2.5 蛋白激酶C (PKC) 是生物体内广泛存在的催化底物进行磷酸化共价修饰的丝/苏氨酸蛋白激酶家族。处于细胞内多种信号途径的交叉口，在许多重要的细胞功能中起信号转导作用。PKCε，一种新型PKC，可能参与重型再障患者血清诱导32D细胞凋亡的信号转导。

　　1.2.6 信号转导子和转录激活子(signal transducers and activators of transcription，Stats) 是一类存在于细胞浆中与酪氨酸磷酸化信号通道偶联的双功能DNA结合蛋白，由750~850个氨基酸组成，分子量为84~113kD。目前已知的Stats家族成员有7个：Stat1、Stat2、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b和Stat6[2]。信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，Stat3)是Stats家族中的一个重要成员。编码Stat3的基因在人类定位于第17号染色体[2]。Stat3广泛表达于不同类型的细胞和组织，参与细胞生长、恶性转化和凋亡等多种生理过程的调控，主要有Stat3α、Stat3β和Stat3γ三种亚型。我们最近的实验(待发表)提示再生障碍性贫血患者血清作用24小时后虽对32D细胞Stat3基因mRNA的表达无影响，但可上调Stat3蛋白磷酸化水平，Stat3蛋白的磷酸化过程可能参与再障患者血清诱导32D细胞凋亡过程的信号传导。

　　1.3 凋亡相关细胞因子的异常

　　1.3.1 负性造血调控因子活性增加 已有不少研究证实，AA患者骨髓和外周血中许多负性造血调控因子表达异常如IFN-γ，或表达增加如TNF-α、TNF-β、MIP-1α等，其中有些细胞因子的异常表达已被发现同造血细胞凋亡有关。Maciejewski等研究发现，TNF-α、IFN-γ在体外可以以剂量依赖方式上调正常人骨髓CD34+细胞Fas抗原的表达，且无需辅助细胞的参与。凋亡检测发现，抗Fas抗体可促使经TNF-α、IFN-γ作用后的骨髓CD34+细胞发生凋亡[4]。Selleri等研究发现，TNF-α、IFN-γ在体外能以剂量依赖方式抑制正常人骨髓CD34+细胞的集落形成能力，且TNF-α和IFN-γ的造血抑制有相加作用，用DNA电泳和原位末端标记法发现TNF-α和IFN-γ能促使骨髓细胞和骨髓CD34+细胞的凋亡，因此推测TNF-α、IFN-γ的造血抑制活性与它们促使造血细胞凋亡有关. 造血组织在体内长期暴露于TNF-α、IFN-γ可以导致造血干/祖细胞池广泛的耗竭，原因是这些造血干/祖细胞发生凋亡而不是一过性的受抑制。同一作者用基因转导技术将IFN-γ基因导入正常骨髓基质细胞后，基质细胞能持续分泌低浓度IFN-γ，将CD34+细胞加入该体系进行长期骨髓培养，5周后发现产生的BFU-E、CFU-GM明显低于对照，当外加该浓度的IFN-γ时未能对CD34+细胞产生抑制作用，而只有外加100倍外源性的IFN-γ时才能产生同样的抑制作用，提示在体内低水平的IFN-γ就可作用于邻近的骨髓细胞抑制造血，并损伤造血干/祖细胞，并能导致造血抑制和造血干/祖细胞永久性地清除[9]。我们将AA患者血清预先用抗IFN-γ单克隆抗体中和，然后再同正常人骨髓CD34+细胞共同孵育，结果发现AA患者血清诱导正常人骨髓CD34+细胞Fas抗原表达增加并促使其凋亡的作用可被抗IFN-γ单克隆抗体部分阻断，从而进一步证实AA患者骨髓和外周血中往往有异常表达的IFN-γ是促使AA患者骨髓CD34+细胞凋亡增加的一个重要的细胞因子[3]。

　　1.3.2 正性造血调控因子受体异常 研究发现，许多造血生长因子(HGFs)在AA患者骨髓和外周血中往往并不缺乏，甚至高于正常人，一般认为其造血细胞凋亡增加是其受体异常所至。正常骨髓CD34+细胞表达flt-3受体、酪氨酸激酶1(STK-1)受体、干细胞生长因子受体(c-kit)及单核细胞集落刺激因子受体、血小板生成素受体(TpoR)、红细胞生成素受体(EpoR)等一系列有关CD34+ 细胞增殖、分化的受体。Manz等研究表明部分AA患者CD34+细胞表面c-kit受体比正常减少2-10倍[10]，Maciejewski等用流式细胞仪分析也表明AA患者CD34+c-kit+细胞显著减少。

　　1.4 端粒缩短及端粒酶活性显著降低 最近，Elaine等报告了一组短端粒和端粒酶活性显著降低的AA患者，10例携带这些突变基因的患者家属也表现为外周血记数轻度异常，干细胞正常或减少。其机理是端粒缩短及端粒酶活性显著降低，可导致造血干细胞衰老，因此推断端粒酶基因的复合突变可能是AA的遗传性危险因子[11]。某些具有该突变的患者家属没有临床症状，且许多患者对免疫疗法有效，提示至少在一些患者中，需要附加的获得性因子(例如免疫攻击)才可引起AA。

　　2 治 疗

　　目前的研究表明，多种基因、信号调控异常导致AA骨髓造血细胞凋亡增加，凋亡增加不仅累及了骨髓中的造血干/祖细胞，而且还累及了外周血中分化成熟的血细胞，它是导致AA骨髓造血干/祖细胞池耗竭和外周血三系细胞减少的重要原因。针对上述原因，临床上可进行以下治疗。

　　2.1 造血干细胞移植 造血干细胞移植，尤其是异基因骨髓移植(allo-BMT)治疗SAA的疗效已获公认。最近，一项研究对1971~1998年间2077例获得性SAA患者接受骨髓移植(BMT)的疗效进行了回顾性分析。大部分患者(1795例)接受了HLA匹配同胞移植，移植时间平均为诊断后3个月，88%的患者移植成功，13%出现严重的急性移植物抗宿主病(GVHD)，1148例(65%)存活;要确定一个患者更适于移植还是免疫抑制疗法，需要考虑患者年龄，有无匹配的同胞供体、活动性感染或输血量大等因素。较年轻的患者通常对移植耐受较好，且移植物抗宿主病(GVHD)病程多较短。对这些患者，建议进行BMT。伴有中性粒细胞值严重降低的患者也倾向于进行BMT，因为BMT可明显缩短嗜中性粒细胞减少的持续时间。

　　2.2 免疫抑制制

　　2.2.1 抗胸腺细胞球蛋白(ATG)/抗淋巴细胞球蛋白(ALG) ATG/ALG是用人的胸腺细胞/淋巴细胞免疫动物后获得的免疫球蛋白复合物，是一种对免疫活性细胞及造血细胞具有多种作用的多克隆抗淋巴细胞血清，属于免疫调节剂。ATG/ALG通过对T淋巴细胞的细胞毒性作用，使外周血淋巴细胞数目在短时间内迅速减少到治疗前的10%以下，从而使负性细胞因子分泌减少。低剂量的ATG还可引发活化T细胞的凋亡并诱导免疫不反应性的发生。目前多采用马ALG15 mg•kg-1•d-1或ALG15 mg•kg-1•d-1的剂量，5天为一疗程。用药前必须进行皮试，并应用肾上腺皮质激素预防过敏反应。单ATG/ALG治疗，效率达40%~70%，可使40%~80%的重型AA患者脱离输血。有些重型AA患者对第一疗程的ATG治疗无反应，可重复使用，约50%~63%的患者可能对第二疗程或更多疗程的ATG起反应。重复使用ATG治疗要注意少数病例在治疗后数月至数年可发展为骨髓增生异常综合征(MDS)、急性白血病、阵发性睡眠性血红蛋白尿。常见副作用为发热、寒战、头痛、血小板计数减少、出血趋势加重、肝功能异常、无菌性骨坏死等。对兔或马蛋白过敏者和有急性病毒感染时，不宜使用上述制品。应用过程中如出现发热、红斑、荨麻疹等不良反应，应立即停药，并用肾上腺皮质激素治疗。

　　2.2.2 环孢素A(CsA) CsA是从土壤里真菌属提取的抗真菌代谢产物。它与其它传统的免疫抑制剂不同，能抑制白介素-2(IL-2)、干扰素等负性细胞因子的合成与释放，阻断免疫细胞的活化与繁殖，诱导和维持重型AA缓解。作为特异性免疫抑制剂，CsA单用治疗AA的疗效为40%~50%，与其它免疫抑制剂合用可明显提高重型AA的有效率与生存率，即使是对用ATG治疗无效者，也有效。治疗重型AA，剂量可从常用剂量的3~6 mg•kg-1•d-1增至 5~15 mg•kg-1•d-1疗程3~4个月以上，多数患者需要用药1~2年。由于CsA的吸收与代谢的个体差异很大，治疗剂量的有效范围又较小，不易确定其狭窄的治疗窗。有条件者需定期检查CsA的血药浓度，并将血药浓度维持在200~400 μg/L左右。CsA具有不抑制骨髓、不增加感染机会、使用方便的优点，但需注意副作用。副作用有手震颤、齿龈增生、多毛、皮肤色素沉着、肝功能损害、间质性纤维化和肾小管萎缩，可致不可逆性肾损害等。

　　2.2.3 ATG/ALG与CsA联用 联用ATG/ALG和CsA，可同时产生ATG/ALG的淋巴细胞毒作用及CsA对淋巴细胞活性的阻抑作用，其免疫抑制作用较单用一种者强。欧洲血液骨髓移植组(EBMT)的回顾性分析显示：该组1974~1990年和1990~1997年先后单用ATG治疗重型AA患者523例和116例，其7年存活率分别为50%和63%;同期单用CsA治疗重型AA患者6例和22例，其7年存活率分别为25%和32%，而同期用ATG加CsA治疗重型AA患者56例和53例，其7年存活率分别为64%和83%,因而联用ATG/ALG和CsA治疗重型AA的疗效高于单用ATG/ALG ，ATG/ALG与CsA合用是最好的一线治疗SAA方案。

　　2.2.4 环磷酰胺 环磷酰胺(CTX)是一种烷化剂，对DNA链产生多种化学作用，能降低外周血淋巴细胞数量，减少IgG、IgM抗体生成，抑制机体的免疫反应。对免疫效应细胞在质和量上均有影响。但接受CTX治疗的患者需要更强有力的支持治疗,且环磷酰胺也无法避免复发或克隆演变;其还可延长严重的中性粒细胞减少的持续时间并招致致命的真菌感染，因而运用这种毒性药物应注意其适应证并需进行严密的检测。

　　2.2.5 大剂量甲基强的松龙 我们过去的研究提示对血清中存在IgG造血抑制物的患者应用大剂量甲基强的松龙疗效显著。剂量为1 g/d×3 d，400 mg/d×1 d，40 mg/d×3 d。

　　2.2.6 达珠单抗 IL-2R特异性抗体。作用机理:针对活化淋巴细胞,有效率50%，用法：1 mg/kg,1次/2周，共用5次。无显著副作用，且疗效持久。安全，可用于门诊。

　　2.3 正性造血生长因子 正性造血生长因子单用AA无效，有学者用G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-1、IL-6及红细胞生成素(EPO)等多种细胞因子单用或合用治疗AA，发现G-CSF和GM-CSF能有效纠正某些AA患者的白细胞减少，因而造血生长因子的辅助治疗仍有发展前景，尤其是使用G-CSF可减少早期感染及相关死亡，同时还可以缩短免疫抑制治疗后起效的时间。因G-CSF费用昂贵，是否需要加用G-CSF可视患者情况而定。

　　2.4 中药治疗 过去强调补肾温阳，现在则主张攻补兼顾。我院的代表药方为“鹿骨再生汤”。

　　2.5 基因治疗 PKCε抑制剂将来有望成为再障分子生物学治疗的新药物。

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