白血病细胞株及人骨髓有核细胞中的表达

　　作者：孙斌,仇灏,胡从莉,沈宏杰,岑建农,吴士　　作者单位：苏州大学医学部生物化学与分子生物学系; 苏州大学附属第一医院血液科, 江苏 苏州

　　【摘要】目的： 从mRNA水平观察不同白血病细胞和人骨髓标本中糖基转移酶β3GalT7/GnT8和β3GnT2的表达情况。 方法： 采用RTPCR技术，在8种白血病细胞株及24例白血病患者骨髓有核细胞中检测β3GalT7/GnT8,β3GnT2 mRNA水平的表达，以10例正常成人骨髓有核细胞作相对正常对照。结果： β3GalT7/GnT8在SHI1,THP1,HL60,K562,NB4,U937细胞和18例初诊白血病患者骨髓标本中有不同程度的表达，在KG1,Raji细胞和相对正常对照中没有表达;β3GnT2在SHI1,THP1,HL60,K562,NB4,U937,Raji细胞，4例相对正常对照和16例初诊白血病患者骨髓标本中有不同程度的表达，在KG1细胞中和6例相对正常对照中没有表达。 结论：3GalT7/GnT8和β3GnT2与白血病的发生发展存在一定的关系，其mRNA的表达水平可以作为白血病早期诊断的一个标志。

　　【关键词】 糖基转移酶,白血病,表达差异; RTPCR

　　[Abstract]Objective: To observe the expression of β3GalT7/GnT8 and β3GnT2 gene in different leukemia cells and patients on mRNA level. Methods： RTPCR was used to detect the mRNA expression in 8 leukemia cells,24 patients and bone marrow of 10 normal persons. Results： Different expression level of 3GalT7/GnT8 can be found in leukemia cells SHI1, THP1, HL60, K562, NB4, U937 and 18 patients who were leukemia at first diagnosis, but never found in leukemia cell Raji，KG1 and bone marrow of normal persons;β3GnT2 expressed in SHI1，THP1，HL60，K562，NB4，U937，Raji，16 patients and 4 bone marrow of normal persons, never found in KG1 and 6 bone marrow of normal persons. Conclusion： β3GalT7/GnT8 and β3GnT2 expression level were related to diagnosis of leukemia.

　　[Key words]Glycosyltransferase; leukemia; different expression; RTPCR

　　白血病是造血系统的恶性肿瘤，是我国最常见的恶性肿瘤之一。其特点是骨髓及其他造血组织中大量白血病细胞无限制的增生，浸润全身各组织和脏器，并进入外周血液，而正常血细胞的制造被明显抑制。癌细胞的侵袭转移是肿瘤患者主要致死原因，而组织浸润和转移高度依赖细胞外基质的改变和细胞间的相互作用，其中涉及细胞表面分子的糖基化[1]。糖基化异常可导致细胞的识别和黏附功能障碍，在成熟细胞中如果出现了早期的分化抗原，某些糖基转移酶的活性升高或降低，就会产生癌变，因此一些糖基转移酶被视为癌变的重要标志[2]。β1,3N乙酰氨基葡萄糖转移酶(β3GnTs)将UDPGlcNAc中的GlcNAc通过β1,3连接催化到Galβ1,4Glc(NAc)的Gal上，在N聚糖中通常由β1,4半乳糖基转移酶基因家族的重要成员GalT4后继催化。肿瘤细胞中聚乙酰半乳糖胺及功能性寡聚糖sialylLex,diLex 增多，促进肿瘤的浸润转移。最近，有学者报道，β3GnT2和β3GnT8能够在体外形成异二聚体，此复合物的催化活性比两者各自的酶活性显著增强[3]。本试验采用RTPCR分别检测8种白血病细胞株和不同白血病患者骨髓有核细胞中β3GalT7/GnT8和β3GnT2的mRNA表达，并以正常成人骨髓标本为对照，进一步揭示β3GnT2和β3GnT8在人体内骨髓有核细胞中的表达情况，希望为白血病的早期诊断和治疗以及研究糖基化与肿瘤之间的关系提供新思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞和患者标本来源

　　红白血病细胞株K562，急性单核细胞白血病细胞株U937，THP1，SHI1，急性粒细胞白血病细胞株HL60，急性原始粒细胞白血病细胞株KG1，急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4，Burkitt淋巴瘤细胞株Raji均由苏州大学附属第一医院血液科提供。病例：由苏州大学附属第一医院血液科诊断的白血病初治患者24例，其中初治AL患者19例(M2，M3，ALL各4例，M4，M5各3例，M1 1例);慢粒患者5例;相对正常对照组为三系下降和血小板下降者共10例。

　　1.1.2 主要试剂与仪器

　　Trizol购自Invitrogen公司，MMLV逆转录酶购自Promega公司，rTaq酶购自TAKARA公司。RTPCR扩增仪GeneAmp System 9600(Perkin ELMER公司);电泳仪MiniProtean3(BioRad公司);紫外透视分析仪BioCAPTversion99(VLIBER LOURMAT)。

　　1.1.3 引物设计

　　引物设计采用DNAstar软件并经Genbank Blast同源检索后由上海生工生物工程有限公司合成。β3GalT7/GnT8引物序列：F：5′CCCTGACTTCGCCTCCTAC3′,R：5′GGTCTTTGAGCGTCTGGTTGA3′，预期扩增长度362 bp。β3GnT2引物序列：F:5′CCAGAAGGCAAGCAAT3′,R:5′TCCCGATGAGGTCCAG3′， 预期扩增长度385 bp。GAPDH引物序列：F：5′AGAAGGCTGGGGCTCATTTG3′,R: 5′AGGGGCCATCCACAGTCTTC3′，预期扩增长度258 bp。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　各种细胞株用含10%小牛血清的RPMI1640培养基(除SHI1用含10%胎牛血清的IMDM培养基)于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱内培养，生长至对数生长期时PBS洗2次，收集细胞。

　　1.2.2 细胞总RNA提取

　　Ficoll法分离患者骨髓标本中的单个核细胞，调节每管细胞数为(2～3)×106，溶于1 ml Trizol，吹打细胞破碎后4℃冰箱过夜。取出融化后加入200 μl氯仿，手摇剧烈混匀，12 000 r/min离心15 min，吸取上清。加入等体积异丙醇，颠倒混匀后4℃放置10 min，12 000 r/min离心15 min。沉淀用70%乙醇和无水乙醇洗后加入适量0.1%DEPC水溶解。

　　1.2.3 RTPCR反应体系

　　RNA模板4 μl、六随机引物2 μl，0.1%DEPC水9 μl 70℃ 5 min，迅速降至4℃，再加入5×MMLV缓冲液8 μl，25 mmol/L dNTP 1 μl，RNAsin 0.5μl，MMLV 1 μl，0.1%DEPC水14.5 μl 37℃ 60 min，95℃ 5 min，迅速降至4℃。将逆转后cDNA冻存于-20℃。10×缓冲液2.5 μl，MgCl2 1.5 μl, dNTP 1 μl, GAPDH上下游引物各1 μl，RT生成的cDNA 1 μl，rTaq酶 0.5 μl， 加dd H2O补至反应体积25 μl 。94℃,5 min预变性, 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火45 s， 72 ℃延伸75 s，循环25次,72 ℃后延伸7 min。取PCR产物8 μl与5×上样缓冲液2 μl混合上样，与100 bp DNA 标准参照物一起在1.5%琼脂糖凝胶(含1/20 000的荧光染料Gel Green)上电泳分离后，用凝胶成像仪摄像并分析结果。然后利用相对表达量[β3GnT8(GalT7)，β3 GnT2表达量/GAPDH表达量]做柱形图(分析软件UVISoft)。

　　1.2.4 统计学分析

　　以SPSS10.0统计分析软件进行统计学分析，广义线性模型分析该基因表达量与细胞来源的相关性。β3GnT8(GalT7)，β3GnT2表达量/GAPDH表达量采用两组样本比较的t检验，P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 β3GalT7/GnT8和β3GnT2在8株白血病细胞株中的表达

　　β3GalT7/GnT8在SHI1，THP1，K562，U937，HL60中有较高表达，NB4有中度表达，KG1和Raji中没有表达。β3GnT2在除KG1之外的7个白血病中都有不同程度的表达。统计学分析结果提示该基因的表达与细胞来源无明显相关性(P>0.1)，β3GalT7/GnT8和β3GnT2分别与GADPH进行两组样本比较的t检验，P<0.05，结果显示：在8种白血病细胞株中β3GalT7/GnT8和β3GnT2基因的mRNA表达有明显差异。

　　2.2 β3GalT7/GnT8和β3GnT2在白血病患者骨髓中的表达

　　在10例相对正常成人组中β3GalT7/GnT8没有表达，β3GnT2有4例少量表达。

　　在24例白血病患者骨髓标本中，β3GalT7/GnT8在18例患者骨髓中有表达，β3GnT2在16例患者骨髓中检测到表达。

　　3 讨论

　　糖基化与肿瘤的发生，特别是肿瘤转移之间的关系，近来越来越受到重视。肿瘤细胞中糖蛋白的糖链结构会发生异常，而且与肿瘤细胞的生物学特性密切相关，如肿瘤细胞的浸润转移、恶性转化等，糖基转移酶的改变是其基础[4]。研究高低浸润性不同的白血病细胞株间糖基转移酶的表达差异,有助于揭示糖基转移酶与白血病细胞株浸润能力的关系,从而为从糖生物学角度诊断、治疗白血病提供思路。我们的实验结果显示：浸润能力强的M5型白血病细胞株SHI1和THP1中β3GnT2和β3GalT7/GnT8基因都有较高表达，而在其他白血病细胞株中表达则相对较低，提示糖基转移酶与白血病细胞株浸润能力可能存在一定的关系。近年的研究表明：β3GnT2和β3GalT7/GnT8具有相似的特异性底物，β3GalT7/GnT8不仅能够增强β3GnT2的活性，并且两个糖基转移酶能够形成酶活性显著增强的异二聚体[5]。实验中我们选取10例理论上可作为白血病对照的缺铁贫和三系下降患者骨髓作为对照，实验结果显示，β3GnT2和β3GalT7/GnT8在不同白血病细胞株中有不同程度的表达;特别是在人骨髓标本的检测中，我们发现：β3GalT7/GnT8在10例相对正常成人均无表达，而在24例初诊白血病患者中，17例患者骨髓中检测到该基因有较高表达;β3GnT2在10例相对正常成人中有4例微弱表达，而在24例初诊白血病患者中，16例患者骨髓中检测到该基因有较高表达，提示β3GalT7/GnT8基因的过表达促使β3GnT2活性增加最终导致恶变细胞中聚乙酰半乳糖胺增多，而促进其浸润转移。β3GnT2和β3GalT7/GnT8在骨髓中的表达异常增高有可能成为一个预警信号，为白血病的早期诊断提供参考信息。关于糖基转移酶与白血病发病机制之间的关系还需要进行进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1]Dennis JW,Granovsky M,Warren CE. Glycoprotein glycosylation and cancer progression[J]. Biochem Biophys Acta,1999,1473(1):21-34.

　　[2]Ovrum E,Brosstad F,Am Holen E,et al.Effects on coagulation and fibrinolysis with reduced versus full systemic heparinzation and heparincoated cardiopulmonary bypass[J].Circulation,1995,92(9):2579-2584.

　　[3]Seko A, Yamashita K.Activation of β1,3NAcetylglucosaminyltransferase2(β3GnT2)by β3GnT8.Possible involvement of β3GnT8 in increasing polyNacetyllactosamine chains in differentiated HL60 cells[J].J Biol Chem,2008,283(48):33094-33100.

　　[4]王克夷. 糖基转移酶的研究进展[J].生物化学与生物物理进展,1994，21(1):9-13.

　　[5]Seko A, Yamashita K.Characterization of a novel galactose β1,3Nacetylglucosaminyltransferase(β3GnT8):the complex formation of β3GnT2 and β3GnT8 enhances enzymatic activity[J]. Glycobiology,2005,15(10):943-951.