丙戊酸钠对慢性粒细胞白血病细胞株Ｋ５６２增殖和凋亡的影响

　　作者：张祥忠　　作者单位：中山大学附属第一医院血液科，广东 广州

　　【摘要】探讨丙戊酸钠(VPA)对慢性粒细胞白血病细胞株(K562细胞)增殖的影响及其可能机制。【方法】 利用CCK-8法检测药物对细胞生长的影响;利用流式细胞仪检测药物处理后的细胞凋亡和细胞周期情况。【结果】 VPA对K562细胞生长具有浓度-时间依赖性抑制作用;同时引起细胞凋亡增加(11.47% ± 0.25%)，与正常对照组(4.77% ± 0.40%)比差异有统计学意义(P < 0.05);G0/G1期细胞增多(82.30% ± 9.41%)，S期细胞减少(12.88% ± 6.99%)，细胞被阻滞在在G0/G1期(P < 0.05)。【结论】 VPA能够阻滞K562细胞于G0/G1期，最终抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡。

　　【关键词】 丙戊酸钠 性粒细胞白血病 K562细胞 增殖 凋亡

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the effects of sodium valproate(VPA) on the proliferation of chronic myeloid leukemia cell line K562，and to explore possible mechanisms. 【Methods】 K562 cells were treated with VPA. Cell proliferation was determined by CCK-8 assay. Cell apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry (FCM). 【Results】 VPA inhibited the proliferation of K562 cells in concentration- and time-dependent manners. The apoptosis rate was significantly higher in the cells treated with VPA than in untreated cells[(11.47%±0.25%)vs(4.77%±0.40%)， P < 0.05]. After treatment of VPA， cell cycle was arrested obviously at G0/G1 phase (P < 0.05). 【Conclusions】 VPA could induce G0/G1 phase arrest， inhibit the proliferation and induce the apoptosis of K562 cells in vitro.

　　Key words： sodium valproate; chronic myeloid leukemia; K562 cell; proliferation; apoptosis

　　近年来研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors，HDACI)可诱导多种肿瘤细胞生长阻滞、分化及凋亡[1-3]。丙戊酸钠(sodium valproate，VPA)是一种传统的抗癫痫药物，其在抗癫痫有效治疗浓度时也表现出很强的HDACI活性[4];慢性粒细胞白血病是临床上一种比较常见的恶性血液病，t(9;22)形成Ph染色体是其特征性细胞遗传学改变，由此形成的Bcr/Abl融合基因是其发病的分子机制和新药物(如格列卫)作用靶点。尽管格列卫取得了极好的疗效，但临床仍然观察到耐药的情况[5]。所以为了克服耐药，临床上迫切需要开发新一代作用于Bcr/Abl融合基因的靶向药物或其他不同机制的抗肿瘤药物。本实验探讨了VPA对慢性粒细胞白血病急变期细胞株K562细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂

　　VPA购自法国赛诺菲安万特公司。1640培养基为Gibco公司产品，胎牛血清(fetal calf serium， FCS) 购自杭州四季青生物公司。CCK-8试剂盒为碧云天公司产品，AnnexinV-FITC 凋亡和细胞周期分析试剂盒为Becton Dickinson 公司产品。K562细胞株由中山大学肿瘤研究所提供。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 细胞培养

　　K562细胞用含100 g/L灭活FCS的RPMI 1640培养液重悬后，置于37 ℃、体积分数5% CO2饱和湿度培养箱中培养，每2 ～ 3天换液1次。

　　1.2.2 CCK-8方法分析细胞增殖活性

　　取对数生长期的K562细胞，调整细胞终密度为1 × 105/mL 接种于96 孔板，分别加入0.5、1、2、5、10 和25 mmol/L的VPA，每孔总体积为200 μL，另设空白孔和对照孔，每个浓度设3个复孔，于加药后72 h检测，每孔避光加入20 ?滋L CCK-8，继续孵育2 h后用酶标仪检测A值，波长450 nm。实验重复3次，取平均值。以药物浓度为横坐标，生长抑制率为纵坐标，绘制浓度-生长抑制率曲线。生长抑制率=[(A对照-A空白)-(A实验-A空白)]/(A对照-A空白) ×100%。另外，通过上述试验结果计算出IC50值，然后以接近IC50值的浓度的VPA处理K562细胞，分别于加药后0，12，24，36，48，60和72 h检测，并计算出生长抑制率，以分析作用时间对细胞增殖的影响。

　　1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期

　　取对数生长期的K562细胞以5 × 106/mL种于6孔板中，分为对照组、VPA(2 mmol/L)组，加药48 h后，收集各组细胞，PBS洗2次，离心弃上清，700 mL/L冷乙醇4 ℃固定过夜后。离心弃去固定液，3 mL PBS重悬5 min，400目的筛网过滤1次，离心5 min，弃去PBS。用1 mL PI染液染色，4 ℃避光30 min。上机检测，进行结果分析。

　　1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

　　取对数生长期的K562细胞以5 × 106/mL种于6孔板中，分为对照组、VPA(2 mmol/L)组，加药48 h后，收集各组细胞，PBS洗2次，离心弃上清，悬溶于结合缓冲液中，调整细胞浓度为1 × 106个/mL。加10 μL异硫氰酸荧光素( FTIC) 标记的连接素(Annexin) 和10 μL的20 mg/ L的普匹碘氨( PI) ，混匀，避光室温孵育10 min。用结合缓冲液洗1次后用Coulter Elite 流式细胞仪(Coulter 公司) 进行分析。Annexin V(-) PI (-) 为活细胞，Annexin V(-) PI (+) 为机械损伤细胞， Annexin V(+) PI(-) 为早期凋亡细胞， Annexin V(+) PI (+) 为晚期凋亡细胞， 实验中以Annexin V(+) 作为凋亡细胞。

　　1.2.5 统计分析

　　用SPSS 11.5统计软件包进行统计分析，结果用x±s表示，多组间比较进行单因素方差分析，两组间均数比较采用t检验，P < 0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 VPA对K562细胞的增殖抑制作用

　　不同浓度(0.5 ～ 25 mmol/L)的VPA均可抑制K562细胞生长，差异有统计学意义(F=15.32， P < 0.05);并且VPA对K562细胞生长的抑制作用在一定浓度范围内呈浓度依赖性。用接近IC50浓度(2 mmol/L)的VPA处理K562细胞不同时间后，结果显示随着孵育时间延长其生长抑制作用明显增强，差异有统计学意义(F=103.77， P < 0.05)。这反映VPA对K562细胞生长的抑制作用在一定时间内也具有时间依赖性。

　　2.2 流式细胞仪检测K562细胞凋亡

　　用2 mmol/L的VPA处理K562细胞在48 h后，以Annexin V/PI双标记后通过流式细胞仪检测，结果显示VPA处理组细胞凋亡率高于未处理对照组，差异有统计学意义(t = 24.375， P < 0.05)。

　　2.3 流式细胞仪分析K562细胞周期

　　用2 mmol/L的VPA作用K562细胞48 h后，细胞周期进程被阻滞，G0/G1期细胞明显较未处理组增加(t = 7.561，P = 0.002)，而S期细胞较未处理组明显减少(t = 8.70， P = 0.001)，差异均有统计学意义。

　　3 讨 论

　　表观遗传学修饰是基因表达的主要调节方式，包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化和RNA干扰等。表观遗传在转录调控上起着极为重要的作用，组蛋白高乙酰化和DNA启动子序列低甲基化可促进基因表达，而组蛋白去乙酰化和DNA启动子序列高甲基化可抑制基因的表达，这两种机制相互协调，共同实现对基因表达的精细调控[6]。近年来研究表明，表观遗传学改变在肿瘤发生中扮演一个重要角色。肿瘤发生的主要表观遗传学改变是抑制肿瘤生长的基因发生DNA启动子序列过甲基化和染色质中的组蛋白去乙酰化修饰。恶性肿瘤的发生、发展过程中常涉及组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase， HDAC)的异常聚集，引起在细胞发育、分化、凋亡过程中起重要作用的基因表达受抑，导致肿瘤的发生[7]。HDACI可以通过抑制HDAC活性，诱导组蛋白高乙酰化，调节基因表达，从而发挥抗肿瘤效应[8]。目前已有多种HDACI 进入了Ⅰ/Ⅱ期临床试验。VPA是一种传统的抗癫痫药物，毒副作用轻微，长期使用患者耐受性好，其在抗癫痫有效治疗浓度时也表现出很强的HDACI活性，可通过诱导细胞周期停滞、凋亡和分化而抑制肿瘤细胞的生长增殖[4，9];对肿瘤细胞有选择性细胞毒性，而对正常造血细胞无严重毒性，且与多种化疗药物有协同作用[10]。HDACI的应用标志着一种全新的肿瘤治疗途径，因此研究HDACI 是通过何种机制来发挥抗肿瘤作用有着积极的实际意义。

　　慢性粒细胞白血病是临床上一种比较常见的恶性血液病，尽管近几年来以Bcr/Abl融合基因的产物P210蛋白作为靶点的新药——伊马替尼(格列卫)取得了极好的临床效果，但是在加速期和急变期患者中仍然观察到了原发性和继发性耐药的现象[5]。所以临床上需要开发新一代作用于P210融合蛋白的靶向药物或其他不同机制的抗肿瘤药物。

　　本实验结果证实了传统的抗癫痫药物同时也是一种HDACI的VPA对K562细胞的生长具有剂量-时间依赖性的抑制作用;同时2 mmol/L的VPA作用48 h后K562细胞凋亡较对照组增加。这说明VPA可能是通过诱导细胞凋亡来抑制K562细胞增殖的。VPA引起细胞凋亡的具体分子机制现在尚未完全阐明。Caspase-3是凋亡效应分子之一，其可以被多种内外源性凋亡诱导因子激活从而引起细胞发生凋亡。有研究发现VPA可引起多种白血病细胞株发生caspase-3依赖性的凋亡，同时它还可以通过不依赖caspase-3活化的途径引起细胞凋亡[11]。所以我们推测其引起K562细胞凋亡的分子机制也有可能比较复杂，需要进一步研究。

　　此外，现在发现HDACI对肿瘤细胞具有阻滞周期进程的作用。Sakura等[12]将VPA和SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)这两种HDACI作用于14种淋巴系统肿瘤细胞株后，细胞发生了G1或G2/M阻滞及凋亡，并且与细胞周期调节有关的p53、p21和p27基因出现表达上调。本实验中VPA处理后G0/G1期细胞比例增加，同时S期细胞比例下降。这说明VPA可以使K562细胞周期进程受到阻滞。其分子机制也可能是上调p21WAF1等细胞周期调节基因的表达，而增多的p21WAF1与CDK结合，抑制CDK活性，从而引起细胞周期停滞，最终可能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。

　　本实验结果表明，VPA能够抑制慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞的生长，并可诱导其凋亡和细胞周期阻滞，这为慢性粒细胞白血病患者的治疗提供了新的途径及一定的理论依据。

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