硫化砷对骨髓增生异常综合征骨髓单个核细胞体外凋亡的作用

　　作者：袁红建,徐瑞容,丁润生,姜胜华,陆伟　　作者单位：南通大学医学院附属医院血液科，南通，226001

　　【摘要】为了研究硫化砷(As2S2)在体外对骨髓增生异常综合征患者骨髓单个核细胞增殖的影响，并探讨其可能的作用机制，采用MTT法、流式细胞术、RT-PCR等多参数检测不同浓度As2S2诱导MDS细胞的凋亡。结果表明：①低浓度(0-0.6 mg/L)的硫化砷对MDS细胞无明显抑制作用;②相对高浓度的硫化砷(1.5-50 mg/L)对低危组MDS以及高危组MDS的单个核细胞均有诱导凋亡作用，且呈时间浓度依赖关系;bcl-2 mRNA 在As2S2 作用后表达明显下调，bcl-2/bax比例明显下降(P<0.05);③MDS病人存在骨髓造血细胞的过度凋亡。结论：MDS病人存在骨髓造血细胞的过度凋亡;低浓度的硫化砷对MDS细胞没有明显的增殖抑制作用，高浓度的硫化砷主要通过诱导凋亡使MDS细胞死亡。

　　【关键词】 骨髓单个核细胞

　　Abstract The aim of this study was to investigate the inhibition effect of arsenic sulfide (As2S2) on the growth of in vitro cultured BMMNC from MDS patients and to explore its possible cellular and molecular mechanisms.The apoptosis of MDS cells induced by As2S2 solution of different concentrations were studied with MTT，flow cytometry，and RT-PCR.The results showed that (1) low concentration of As2S2(0-0.6 mg/L)had no marked inhibition effect on proli-feration of MDS cells;(2) after treatment with 1.5-50 mg/L of As2S2，both low risk MDS cells and high risk MDS cells presented typical features of apoptosis with a dose-dependent manner，the expression of bcl-2 mRNA and the ratio of bcl-2/bax obviously decreased after As2S2 treatment (P<0.05); (3) BMMNC from MDS patients had higher apoptosis ratio than that of BMMNC from control.It is concluded that BMMNC excessive apoptosis exists in MDS patients; low concentration of As2S2(0-0.6 mg/L) shows no inhibition effect on proliferation of MDS cells;high concentration of As2S2(1.5-50 mg/L) induces apoptosis of MDS cells.

　　Key words myelodysplastic syndromes ;arsenic sulfide; BMMNC; apoptosis; bcl-2; bax

　　骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)是一种造血干细胞异常克隆性与异质性疾病，其主要特征为病态造血和无效造血，部分患者易向白血病转化。MDS发病率有逐年上升趋势[1]，但目前对其治疗仍无很好的方法。经研究发现，砷剂具有致癌、致畸、致突变的协同作用;作为微量元素，砷尚能促进造血、细胞生长和繁殖[2]。硫化砷(As2S2)是中药雄黄的主要成分，近年来，用雄黄治疗MDS取得了一定的疗效[3]，本研究以观察硫化砷(As2S2)在体外对MDS骨髓单个核细胞的作用，查明其可能的治疗机理，开发其应用领域。

　　材料和方法

　　病例选择

　　MDS患者25例，按照FAB分型[4]，RA 15例，RAS 3例，RAEB 5例，RAEB-t 2例。男性16例，女性9例，中位数年龄45(19-80)岁，为初诊及复诊的患者，每例均经骨髓细胞形态学和骨髓病理等相关的实验室检查确诊。以上病例来自南通大学附属医院血液科。

　　标本采集和细胞分离

　　自髂后上棘抽取5 ml骨髓液，0.1%肝素抗凝，采集后2小时内用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离骨髓单个核细胞，RPMI 1640培养液洗3遍，制成细胞悬液，计数备用。

　　试剂

　　硫化砷(As2S2)购自美国Sigma公司，纯度99.99%，以0.2 mol/L NaOH 溶解，HCl中和滴定至pH 7.35-7.45，制成0.1%的储存液，4℃保存。MTT购自美国Sigma公司，临用前以PBS配制成5 mg/ml，抽虑除菌，保存在4℃条件下。RT-PCR试剂盒购自晶美公司，AnnexinV FITC试剂盒购于联科生物公司。

　　MTT增殖抑制实验

　　硫化砷分成7种不同浓度(0.3、0.6、1.5、3.0、15、30、50)mg/L组，加上调零孔(没有细胞和药)和对照孔(不加药)，共为9组，每组设5个复孔。分离的骨髓单个核细胞以每孔1 000-10 000个接种到96孔板，每孔体积200 μl，培养液为含不同浓度的硫化砷的RPMI 1640(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素);37℃，5% CO2条件下分别培养24、48、72小时，每孔再加入MTT 20 μl，孵育4小时，小心弃上清，加二甲亚砜150 μl振荡溶解10分钟，用酶标仪测490 nm波长A值，取5孔A490的均值，计算抑制率。抑制率=(阴性对照的A值-实验孔的A值)/阴性对照的A值×100%。

　　流式细胞术检测

　　分离的骨髓单个核细胞以(2-5)×105/mL浓度接种在含硫化砷的RPMI 1640培养液中进行培养(37℃，5% CO2)，分别取培养前(0小时)、培养后24小时、48小时的 细胞，以Annexin V-PI进行标记后，用流式细胞仪检测。

　　荧光共聚焦显微镜观察

　　硫化砷处理后的细胞和未经处理的细胞以 Annexin V 和PI标记，收集细胞涂片，用荧光共聚焦显微镜观察并拍摄图片。

　　RNA抽提和bcl-2与bax mRNA 转录的RT-PCR检测

　　用TrizoL试剂盒(Gibco公司)提取细胞总RNA后测定其浓度和纯度(紫外分光光度仪，Pharmasia公司)。RT反应体系包括RNA 1-5 μg，oligo(dT)18 Primer (0.5 μg/μl 1 μl，5×缓冲液 4 μl，dNTP (l0 mmol/L) 2 μl，RNasin (20 U/μl 1 μl，M-MuLV逆转录酶(200 U/μl 1μl，总体系20 μl;RT-PCR引物见表1。50 μl PCR体系包括：逆转录反应产物2 μl，上游及下游引物(10 pmol/L)各2 μl，dNTP (10 mmol/L) 0.8 μl，Taq DNA合成酶(25 U/μl 0.5 μl，MgCl2 (25 mmol/L) 3 μl，10×PCR buffer 5 μl;反应参数：95℃预变性5分钟，94℃ 40秒，55℃ 40秒，72℃ 40秒，72℃ 7分钟，各反应32个循环;反应产物各取10 μl，1.8%琼脂糖凝胶电泳，电压100 V;凝胶成像系统(Bio-Rad公司)记录并对条带作半定量分析。RT-PCR试剂由晶美生物工程有限公司提供，引物合成由北京华大中生科技发展有限公司提供。Table 1.Primers of RT-PCR(略)

　　统计学分析

　　实验数据用x±SD表示，采用单因素方差分析、多因素方差分析和q检验，分析实验结果整体差异的显著性;用t检验分析对照组和用药组之间差异的显著性;IC50用回归方程计算。应用STATE 7.0统计软件进行统计分析，以P<0.05为差异具有显著性意义。

　　结果

　　硫化砷(As2S2)对MDS骨髓单个核细胞生长的影响

　　不同浓度的硫化砷(As2S2)对MDS骨髓单个核细胞具有不同的作用。经MTT法检测，低浓度的硫化砷(0-0.6 mg/L)对MDS骨髓单个核细胞无明显生长抑制作用(F=0.95，P=0.46);相对高浓度(1.5-50 mg/L)的As2S2处理MDS骨髓单个核细胞，具有不同的生长抑制作用(F=22.0，P<0.001)(表2、表3，图1)，As2S2作用于MDS骨髓单个核细胞不同时间，其生长抑制作用也不同(F=14.31，P<0.001)(图2)。经回归分析拟合趋势线和方程计算，其24、48和72小时 IC50分别为44.24、8 和2.57 mg/L。Table 2.Effect of As2S2 on growth of MDS cells by MTT test (略)

　　As2S2对MDS骨髓单个核细胞凋亡的影响

　　经流式细胞仪检测，MDS病人存在骨髓造血细胞的过度凋亡(表4)，对照组、低危MDS组、高危MDS组培养前的凋亡率各不相同(F=48.74，P<0.05)，低危及高危MDS病人的单个核细胞凋亡率与对照组相比均有明显增高，[低危MDS与正常对照比(q =28.73，P<0.05);高危组MDS与对照比(q=17.98，P<0.05)，而低危组MDS比高危组MDS有更高的凋亡率(q=10.75，P<0.05)]。硫化砷对3组单个核细胞均有诱导凋亡作用(配对t检验，P<0.05);硫化砷对3组单个核细胞诱导凋亡作用不同(F=444.82，P<0.05);硫化砷对高危组MDS具有更强的诱导凋亡作用[(高危组与对照组(q=0.52，P<0.05);高危组与低危组(q=0.54，P<0.05)];而低危组与对照组之间无明显差别(q=0.017，P=0.57)。流式细胞术检测结果见图3。荧光显微镜下可见经As2S2处理后的MDS骨髓单个核细胞中，凋亡细胞和死亡细胞均有增加(图4)。Table 4.Flow cytometry analysis of apoptosis ratio of BMMNC from different types of MDS and control induced by As2S2(1.5 mg/L) treatment for different length of time (略)

　　As2S2对MDS细胞bcl-2、bax mRNA 表达影响

　　3 mg/L As2S2处理MDS细胞24小时后，测定bcl-2、bax mRNA 表达结果如图5。所有细胞均有bcl-2、bax mRNA 表达，未处理组bcl-2/bax为0.730±0.088;经3 mg/l的As2S2作用24小时后，bcl-2/bax为0.412±0.073，两组比较差异有显著性(t=7.87，P<0.05);而在高危组MDS和低危组MDS之间未检及差异(P<0.05)，相关数据见表5。 Table 5.Analysis of bcl-2/bax mRNA of BMMNC in MDS patients measured by RT-PCR(略)

　　讨 论

　　近年来的研究发现，MDS病人的骨髓中存在比较高的细胞凋亡比例。Raza等[5]通过给MDS病人静脉中注射碘去氧鸟苷和(或)溴去氧鸟苷，再取骨髓活检样本，经单克隆抗体原位标记碘/溴去氧鸟苷测定标本中的S期细胞证实，S期的细胞比例明显增加。MDS病人以贫血和全血细胞减少为特征，经同时标记细胞核DNA断端法证明，MDS病人尚存在造血细胞的过度凋亡。用Annexin V荧光试剂对凋亡早期磷脂酰丝氨酸外翻的细胞胞膜进行标记，同时碘化丙锭能被凋亡早期的细胞胞膜排除在外，而只能进入死亡或凋亡后期的细胞中，从而使我们能够区别早期凋亡和死亡细胞。Mcrchant等[6]用此方法测得MDS病人骨髓单个核细胞的凋亡率平均为44.7%(29.5%-60%)，而对照组的凋亡率平均为11.6%(1.5%-21%)。本实验用此方法测得的低危组MDS的凋亡率平均为41.21%，高危组MDS的凋亡率平均为30.46%，对照组的凋亡率平均为12.48%，与文献报道基本相仿。本实验中测得的对照组的凋亡率与低危及高危MDS病人均有差别，实验结果支持MDS病人骨髓细胞的过度凋亡是MDS病人的重要病理特征的结论，推测骨髓细胞凋亡和增殖比例的失调是造成MDS病人无效造血和三系血细胞减少的重要原因，改变MDS凋亡和增殖比例可能是改善病人贫血、提高生活质量的有效途经。

　　有学者用雄黄治疗MDS时发现其对MDS高危组(RAEB、RAEB-t)的病人有较好的疗效[3]。本实验用MTT法检测雄黄的主要成分As2S2对MDS病人的骨髓单个核细胞的作用，发现3 mg/L以上As2S2能够抑制MDS细胞的增殖并诱导其凋亡，并且其效应与时间和浓度成正比，MDS细胞出现凋亡细胞的特征性形态学改变，流式细胞仪检测出细胞表面外翻的磷酸酰丝氨酸，这些都说明在一定剂量下，硫化砷可通过抑制细胞增殖、诱导凋亡而起作用。

　　现已发现许多基因与细胞凋亡有关，包括bcl-2家族、Apo-1/Fas(CD95)、c-myc、白细胞介素-1β转化酶(ICE)家族(即caspase家族)、p53等。这些基因在凋亡过程中起着不同的作用.Bcl-2蛋白家族是凋亡的主要调节者，其家族成员包括抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-XL，Mcl-1，Al/Bfl-1和凋亡蛋白Bax，Bcl-XS，Bak，Bik和Bad.这些蛋白彼此形成二聚体，它们之间的比率影响着肿瘤细胞对各种凋亡刺激因子的敏感性或抗性，最终决定细胞的生死存亡[7，8]。其中研究最多的是Bcl-2和Bax。Bcl-2(B cell leukemia/lymphoma-2)基因最早是从小鼠B细胞淋巴瘤中分离出来的，其编码的蛋白质由239个氨基酸残基组成。Bcl-2由于能够抑制许多因素介导的细胞凋亡而引起人们的极大关注[9]。Bax与Bcl-2具21%同源性，由192个氨基酸残基组成。 Bax/Bax二聚体在体内过量表达时，可促进细胞凋亡。Bcl-2是通过与Bax形成异二聚体行使其功能的。caspase原通过与凋亡诱导蛋白Apaf-1的NH2-末端区域结合而激活，抗凋亡蛋白如Bcl-XL则可直接与Apaf-1结合，抑制它同caspase原的交联，从而抑制caspase-9的激活[10]，而Bax则可直接拮抗Bcl-XL的作用，它可把Apaf-1从Bcl-XL的结合中释放出来，从而激活caspase，发生自身催化的化学反应，引起线粒体膜电位下降，细胞内活性氧物质升高、降解，内源性核酸内切酶激活、降解，出现形态上可见的凋亡。

　　研究结果表明，Bcl-2抑制凋亡必须通过与Bax形成二聚体来实现。Bcl-2能与Bax结合，抑制其促凋亡的功能，Bcl-2/Bax比率是影响细胞凋亡的关键[11]。本实验发现，MDS病人的骨髓单个核细胞在硫化砷作用后，Bcl-2/Bax比率均出现了有统计学意义的增大，说明了硫化砷对MDS骨髓单个核细胞的作用主要是诱导其凋亡，其作用MDS骨髓单个核细胞后下调bcl-2基因的表达，轻度上调bax基因的表达，导致bcl-2/bax的比值上升;并且Bcl-2/Bax比率的变化可能是MDS造血干细胞凋亡过程中的重要的决定因素。

　　【参考文献】

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　　3 高学熙，王信琪，马建军.雄黄治疗骨髓增生异常综合征14例.临床内科学杂志，1998;15：125-126

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　　10 Perkins C，Kim CN，Fang G，et al.Arsenic induces apoptosis of multidrug-resistant human myeloid leukemia cells that express Bcr-Abl or overexpress MDR，MRP，Bcl-2，or Bcl-xL.Blood，2000;95: 1014-1022.

　　11 Prochazkova J，Lichnovsky V，Kylarova D，et al. Involvement of p53 and Bcl-2 family proteins in regulating programmed cell death and proliferation in human embryogenesis.Gen Physiol Biophys，2004;23: 209-229