裸鼠腹腔输注体外扩增的阵发性睡眠性血红蛋白尿症病人骨髓CD34+CD59+细胞的研究

　　作者：钟玉萍,武永吉,沈悌,汪玄,张洁萍　　作者单位：首都医科大学附属北京朝阳医院(京西院区)血液科 北京 100043;1中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院血液科 北京 100730

　　【摘要】应用BALB/c裸鼠为移植模型，将在体外扩增的阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)病人的CD34+CD59+细胞进行移植，研究其增殖能力和重建造血的情况，为实现PNH患者进行临床自体骨髓移植(ABMT)或自体外周血干细胞移植(APBSCT)奠定基础。本研究利用免疫磁珠双阳性分选法，从PNH患者骨髓中分离出足够数量的CD34+CD59+细胞进行体外扩增，并将体外扩增的细胞输注给接受亚致死剂量照射的BALB/c裸鼠。结果显示：移植6周后，用流式细胞术和DNA检测方法均检测到裸鼠骨髓、脾脏和外周血中人的CD45+细胞，而接受PNH病人CD34+CD59+细胞移植后的裸鼠，其血常规指标有一定恢复，但并未完全恢复。结论：PNH病人骨髓CD34+CD59+细胞体外扩增后仍能保持造血祖细胞的生物特性，在照射的裸鼠中能重建造血。

　　【关键词】 阵发性睡眠性血红蛋白尿症

　　Abstract Ex vivo expanded human bone marrow CD34+CD59+ cells from patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) were transplanted into BALB/c mice in order to investigate their proliferation ability and reconstruction of hemopoiesis，and to lay the groundwork for clinical ABMT/APBSCT in PNH patients. CD34+CD59+ cells were selected from the bone marrow mononuclear cells in PNH patients by using immunomagnetic positive double sorting. Sublethally irradiated BALB/c mice were transplanted with CD34+CD59+ cells enriched from bone narrow of PNH patients.The results showed that human CD45+ cells were detected in the bone marrow，spleen and peripheral blood of the nude mice by flow cytometry and DNA analysis at 6 weeks post-transplant. Blood routine indicators of nude mice were found to recover to some extent，but did not fully recover. It is concluded that ex vivo expanded bone marrow CD34+CD59+ cells from patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria could keep their biological characteristics and ability to reconstruct hemopoiesis in irradiated BALB/c mice.

　　Key words paroxysmal nocturnal hemoglobinuria;CD34+CD59+ cells;cell expansion;nude mice

　　阵发性睡眠性血红蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)是一种慢性溶血性疾病，其治疗长期以来一直停留在对症处理上，同种异体骨髓移植是目前唯一有效的根治方法，但由于HLA相合供体的缺乏、异体移植造成的免疫排斥和治疗费用的昂贵限制其广泛应用。因此，寻找有效的根治PNH的疗法是我们临床医生迫切需要解决的问题。由于PNH病人体内正常克隆与异常克隆并存，因此可以考虑对PNH病人进行自体骨髓移植(ABMT)或自体外周血干细胞移植(APBSCT)。PNH病人的造血祖细胞可以在体外收集，应用免疫磁珠双阳性标记的方法将正常细胞与异常克隆分开，对正常细胞在一定条件下进行体外扩增，待化疗和(或)免疫抑制剂尽量减少患者体内异常造血干/ 祖细胞后，再回输给病人重建造血以期根治PNH。我们以前的工作表明，应用免疫磁珠方法对细胞可进行两次分选得到高富集度的CD34+CD59+细胞，并对CD34+CD59+细胞进行体外扩增，但扩增的细胞能否在体内担当重建造血的重任?本研究以BALB/c裸鼠为动物模型对此问题进行了探讨。以裸鼠为动物模型对PNH患者造血细胞进行研究的问题，国内尚未见有报道。本研究的结果将会加深对PNH发病机制的认识，并为PNH根治途径的探讨提供重要的实验依据。

　　材料和方法

　　研究对象

　　8例PNH患者系我院门诊和住院的病人，均按文献〖1]标准确诊，经髂骨穿刺肝素抗凝获取骨髓。

　　CD34+CD59+细胞的[2]免疫磁珠双阳性法分离富集

　　常规分离骨髓单个核细胞(BMMNC);CD34单克隆抗体标记及CD59单克隆抗体标记与免疫磁珠结合;用MiniMACS分选CD34+细胞;然后分离CD34+CD59+细胞及CD34+CD59-细胞;再用流式细胞仪测定CD34+CD59-细胞与CD34+CD59+细胞的比例。

　　细胞体外扩增培养

　　用本实验室成熟的体外扩增培养体系进行扩增[3]，分别于第4、7、10、14天半量换液，补充含相同细胞因子及浓度的IMDM(表1)，取出细胞进行有核细胞计数，台盼蓝染色，进行CD34+CD59+细胞比例测定及各系造血祖细胞检测。CD34+CD59+细胞的扩增倍数由下述公式计算得出：

　　扩增倍数=(扩增后的有核细胞数)× (CD34+CD59+%)÷扩增前的基数

　　裸鼠骨髓移植

　　BALB/c裸鼠(中国医学科学院动物所提供)，雌雄各半，6-8周龄，体重16-20 g，所有裸鼠在相对无菌及无特定病原体条件下饲养于中国协和医科大学北京协和医院动物房。移植前3小时接受X线照射预处理，照射面积35 cm×35 cm，照距100 cm，剂量率200 cGy/min，照射时间2.00-2.75分钟，总剂量400-550 cGy[4，5]。

　　实验分组

　　实验组(8只)：经腹腔输注扩增后第7天含1×105的CD34+CD59+细胞;阴性对照组(4只)：输注等量的无细胞培养液。

　　人造血祖细胞植入裸鼠体内的检测

　　按参考文献〖6]进行输注PNH病人CD34+CD59+细胞后6-8周用硫喷妥钠按50 mg/kg的浓度麻醉处死裸鼠。取外周血、两侧股骨的骨髓细胞及脾脏，用于人CD45+细胞的检测及抽提基因组DNA，以检测人特异的Alu序列，并进行人的造血祖细胞的分析。测定移植后血常规指标的变化，了解裸鼠造血重建情况。

　　统计学分析

　　运用SPSS统计软件处理数据，对二者间的比较用t检验，三者间的比较用单因素方差分析或两因素随机区组的方差分析。

　　结 果

　　PNH患者骨髓中CD34+CD59+细胞的分选

　　8例PNH患者应用免疫磁株双阳性分选法分选的CD34+CD59+细胞富集度为(85.73±5.42)%。根据以往的经验，造血祖细胞在扩增到第7天时扩增倍数最高。因此，本实验中细胞体外扩增仅7-10天。CD34+CD59+细胞第7天时扩增19.78±3.11倍。

　　裸鼠生存情况的观察

　　照射后存活的裸鼠在2-3周时均出现消瘦、皮肤散在出血点及干燥脱屑，3周后逐渐消失。PNH正常造血祖细胞(CD34+CD59+)体外扩增后输注组裸鼠均存活6周以上。

　　人特异性CD45+细胞的检测

　　实验组存活的8只裸鼠中均检测到人源性CD45+细胞，CD45+细胞数在外周血、骨髓及脾脏中分别为(3.10±1.24)%，(18.62±6.14)%，(15.65±2.45)%(图1);在 阴性对照组裸鼠未检测到人CD45+细胞。

　　造血祖细胞在裸鼠体内分化的检测

　　进一步分析裸鼠骨髓中CD45+的人的细胞可以发现各系表达的标志。在实验中我们检测到B系的表达(CD19+)、T系的表达(CD3+)、髓系的表达(CD14+、CD33+)以及祖细胞的标志(CD34+、CD38+)。它们分别占CD45+细胞的(13.35±1.81)%、(3.50±1.23)%、(6.32±1.32)%、(11.28±1.03)%、(1.54±1.14)%和(4.71±1.12)%。

　　特异性基因植入裸鼠的检测

　　以正常人的阳性标本作为阳性对照，阴性对照未检测到任何特异性条带，实验组小鼠的外周血、骨髓及脾脏组织中均可见到人的特异性Alu序列。

　　移植后裸鼠外周血血常规的检测

　　阴性对照组在10-13天时的血象表现为三系细胞减低，尤以白细胞和血小板减少为显著。实验组在6-8周时的血常规检查显示，白细胞、血红蛋白及血小板并没有完全恢复，但较阴性对照组明显改善(表2)。阴性对照组白细胞及血小板数同实验组比较有显著差异(P<0.05)，而血红蛋白在两组间无明显差异(P>0.05)。

　　讨论

　　PNH是一种慢性难治的疾病，目前的治疗主要是对症治疗，异基因骨髓移植是目前唯一有效的根治方法。Saso等[7]报道了最大宗的临床试验，有57例病人接受了清髓性异基因骨髓移植，其中48例以HLA相合同胞兄妹为供者的患者，2年生存率为56%;2例以孪生姐妹为供者的患者移植后8年及12年仍然存活;7例无关供者中只有1例移植后5年仍然存活。19例(33.3%)在移植后4个月内死亡。治疗失败的主要原因为移植物抗宿主病(GVHD)和感染。因此，骨髓组织的相容性对移植成功至关重要。由于PNH病人体内呈异常造血与正常造血并存的状态，如果能利用PNH病人自身的正常造血部分进行ABMT或APBSCT，那么既能避免异基因骨髓移植中的GVHD，又不存在相合供体缺乏的问题，而能安全有效地治疗PNH[8]。但欲从骨髓及外周血中收集到足够量的正常造血祖细胞(CD34+CD59+)以供ABMT或APBSCT之需是非常困难的，为此必须对PNH病人的CD34+CD59+细胞进行体外扩增。为了给临床应用提供实验依据，必须将体外扩增后的PNH病人CD34+CD59+细胞移植给体重较小的动物，以了解扩增后的CD34+CD59+细胞在体内的生物学特性。

　　本研究采用磁珠双阳性分离方法，即有两种抗原标志的同一细胞被分离纯化出来。在无血清体外培养体系中经SCF、IL-3、IL-6、FLT-3、TPO、EPO组合作用后，PNH病人的有核细胞数、CD34+CD59+细胞及CFC均有不同程度的扩增。PNH患者CD34+CD59+细胞扩增第7天时有核细胞数可扩增137.22±8.54倍，CD34+CD59+细胞绝对值可扩增19.78±3.11倍，CFC扩增34.22±6.81倍。我们通过选择适宜的细胞因子组合及适宜的扩增时机，在体外培养的条件下，能够对PNH病人骨髓来源的正常造血祖细胞(CD34+CD59+)在数量上进行有效的扩增，那么扩增后CD34+CD59+细胞是否仍具有向多系分化重建造血的能力?肖娟等[9]对PNH病人骨髓CD34+CD59+的CD34+抗原表达情况及CFC进行研究发现:PNH病人的CD34+CD59+细胞的不同扩增时段(4、7、10、14天)的CD34+CD59+细胞与其相应的CFC相比较，呈正相关，说明扩增后的CD34+CD59+细胞仍具有形成CFU的能力，具备一定的重建造血性能。为进一步将体外扩增的CD34+CD59+细胞应用于临床，我们以BACL/c裸鼠为移植模型，并以该模型为基础，进一步分析了PNH病人造血祖细胞的生物特性。

　　虽然骨髓被认为是造血的主要部位，但PNH病人体外扩增的CD34+CD59+细胞移植给裸鼠后，其外周血、脾脏中均可检测到人的CD45+细胞，但其比例低于骨髓。应用流式细胞仪进行三色法分析CD45+细胞亚群中各系细胞的表达发现：裸鼠骨髓内的CD19、CD3、CD34、CD33、CD14的表达均为阳性，其中CD3的比例最低，为(2.54±1.14)%，这可能与裸鼠本身具有的T细胞免疫缺陷有关。

　　PNH病人正常造血祖细胞体外扩增后输注给BACL/c裸鼠，处死裸鼠后对其外周血象的检查发现，三系血细胞均未恢复正常，血红蛋白降低最明显，这可能与PNH病人本身存在的造血衰竭有关，而且体外实验也发现，PNH病人CD34+CD59+细胞的扩增倍数低于正常人。但同阴性对照相比仍有显著差异，说明PNH病人CD34+CD59+细胞经体外扩增后仍能保持造血祖细胞的特性并且能支持造血。对PNH病人骨髓来源的CD34+CD59+细胞进行体外扩增仍具有广阔的前景：①体外培养过程中产生的粒系及巨核系细胞可用于克服移植早期的粒细胞减少及血小板减少症。②所有PNH病人骨髓中造血祖细胞的数量仍少，不能达到基因治疗所需的靶细胞数量，但通过对PNH病人造血祖细胞体外扩增，则可能满足基因治疗的需要。

　　【参考文献】

　　1张之南主编.血液病诊断及治疗标准.第二版，北京:科学出版社，1998: 88-90

　　2肖娟，武永吉，张之南等.磁珠双阳性分选法在阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓CD34+CD59+细胞体外扩增的应用. 中国实验血液学杂志，2003;11： 179-183

　　3肖娟，武永吉，张之南等.阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓CD34+CD59+细胞的体外扩增.中华血液学杂志，2002;23: 568-570

　　4Wermann K，Fruehauf S，Haas R，et al. Human-mouse xenografts in stem cell research. J Hematother，1996;5: 379-390

　　5赵小英，吴东，徐荣臻. 裸鼠腹腔输注体外扩增人脐血干/祖细胞的研究. 中华血液学杂志，2002;23: 656-657

　　6Zhang XB，Li K，Fok TF，et al.Cobblestone area-forming cells，long-term culture-initiating cells and NOD/SCID repopulating cells in human neonatal blood: a comparison with umbilical cord blood. Bone Marrow Transplant，2002;30: 557-564

　　7Saso R，Marsh J，Cevreska L，et al. Bone transplants for paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Br J Haematol，1999;104: 392-396

　　8Suenaga K，Kanda Y，Niiya H，et al. Successful application of nonmyeloablative transplantation for paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Exp Hematol，2001;29: 639-642

　　9肖娟、武永吉，张之南等.阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者骨髓CD34+CD59+细胞与CD34+CD59-细胞生物学性能的研究.中华血液学杂志，2003;24: 169-173