氢醌对体外培养骨髓基质细胞核转录因子表达的影响

　　作者：杨海玉,杨建国,王光汉,俞康　　作者单位：江苏泰州疾病预防控制中心，泰州 225300; 1温州医学院附属第一医院，温州 325003

　　【摘要】为了研究氢醌(hydroquinone，HQ)对细胞激活剂佛波酯(PMA)导致的骨髓基质细胞(BMSC)核转录因子表达的影响，并初步探讨其与苯的血液学毒性的关系。用体外培养法获得骨髓基质细胞，观察其形态学变化;分别用NF-κB P65免疫组织化学方法和TransAM P65试剂盒测定了用不同浓度的氢醌加激活剂PMA刺激后的骨髓基质细胞NF-κB蛋白表达和活性的动态变化。结果表明：各组细胞加入HQ后，与对照组相比，P65蛋白由细胞核转回至胞核周围的细胞浆，染色呈弱阳性;不同浓度的HQ作用不同时间后NF-κB活性测定结果与对照组间具有明显差异;各组之间相比，100 μmol/L的HQ作用72小时对NF-κB的抑制作用最明显;而0.1 μmol/L的HQ几乎无抑制作用。结论： HQ可抑制体外培养骨髓基质细胞核转录因子的激活，并且随HQ浓度和作用时间而增强，推测可能与苯的造血微环境毒性有关。

　　【关键词】 基质细胞,体外培养,氢醌;核转录因子

　　Abstract This study was aimed to investigate whether hydroquinone (HQ) can inhibit NF-κB expression activated by phorbol myristate acetate (PMA)，and to explore the relationship between the mechanism and the hematology toxicity of benzene tentatively. The human bone marrow stromal cells (BMSC) were harvested by in vitro culture and their change of morphology were observed. The activity and protein expression of NF-κB p65 extracted from those BMSC were measured with immunohistochemistry and TransAM P65 kit. The results showed that in cells exposed to HQ，P65 transferred from cell nucleus to cytoplasma around cell nucleus and its concentration lowered by immunohistochemistry. And TransAM P65 kit assay revealed that HQ effects at different concentrations were distinctive at respective time.The detected parameters in 100 μmol/L HQ group were significantly different from control group after exposure for 72 hours. But the parameters at different time in μmol/L HQ group were not obviously different. It is concluded that hydroquinone can inhibit NF-κB activated by PMA in BMSCs culture. This kind of inhibitory action correlated with the concentration of HQ and exposure time.

　　Key words stromal cell; culture in vitro; hydroquinone; NF-κB

　　苯是一种应用广泛的溶剂和化工原料[1-5]，目前还不能停止它的使用;但另一方面，苯也是一种主要的环境污染物和毒物。苯对血液系统的影响主要表现为抑制骨髓的造血功能，导致血液系统病变，抑制基质细胞的生长，并通过干扰骨髓基质细胞分泌造血生长因子的能力，抑制骨髓的造血功能，导致血液系统病变，如贫血、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症(MDS)、白血病等。到目前为止，苯诱发再生障碍性贫血等疾病的机制仍不完全明确，但可以肯定的是苯主要通过其代谢产物氢醌、苯醌等发挥毒性作用。本研究观察氢醌诱导体外培养骨髓基质细胞NF-κB活性、蛋白表达的动态变化，旨在探讨NF-κB的表达抑制在苯对造血微环境损害中的作用，从而为进一步研究苯相关再生障碍性贫血与造血微环境的关系，为再生障碍性贫血的发病机理的查明、预防和治疗提供实验依据。

　　材料和方法

　　标本

　　骨髓液取自来医院体检中心就诊的成人志愿者(年龄20-45岁)的骨髓，要求骨髓常规检查无数量及形态学改变。肝素抗凝(肝素100 U/ml)，加入等量含20%胎牛血清的RMPI 1640培养液充分混合成细胞悬液。

　　骨髓基质细胞培养[6]

　　将上述细胞悬液反复抽吸吹打制成单细胞悬液后，1 000r/min 离心20分钟，用IMDM重新悬浮细胞，种于30 ml的塑料培养瓶中，置于饱和湿度、5% CO2、37℃培养箱中培养，5天后开始换液，以后每隔3-4天更换培养液1次。待细胞铺满培养皿底面后，用含有0.25%的胰酶作消化液进行传代培养。用流式细胞仪计数各生长阶段细胞，绘制生长曲线。

　　细胞形态学观察

　　利用倒置相差显微镜对细胞生长和形态变化特点进行动态观察，并照相。

　　加入氢醌和佛波酯

　　培养细胞计数，转移至6孔培养板中，调整每孔细胞密度为1.0×105/ml。氢醌被溶解在D-Hanks液中，然后加入到其中A-C孔细胞中，最终达到3个浓度10、1和0.1 μmol/L，D孔加入等量缓冲液作阴性对照，E孔加入NF-κB特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)作阳性对照，接着立即加入佛波酯于5孔中，另选4孔用于免疫组织化学检测，预先在培养孔内加上盖玻片，每孔培养体系最终调整为5 ml，参照相关文献[7-9]，A-E孔细胞孵育分12，24和72小时共3组，每组再重复5次。

　　细胞活力测定

　　取细胞悬液0.5 ml加入试管，加入0.5 ml 0.4%台盼蓝染液，染色2一3分钟。吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片;镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼蓝染上色，镜下可见深蓝色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活细胞百分数=活细胞数/总细胞数×100%

　　细胞免疫化学和S-P染色[5]

　　在各时相点挑取玻片，用0.1 mol/L PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛50 μl固定40分钟，0.1 mol/L PBS漂洗3次，加3%过氧化氢，于室温下静置10分钟;0.1 mol/L PBS漂洗3次，加5%山羊血清于37℃静置30分钟;吸弃血清，加1∶100稀释的P65抗体，于37℃静置3小时，4℃过夜;用0.1 mol/L PBS 漂洗3次，加生物素标记的二抗(Ig/ Bio1∶20)37℃静置2小时，用0.1 mol/L PBS漂洗3次，加HRP/ SP(1∶200)复合物于37℃培养2小时，0.1 mol/L PBS漂洗3次，DAB法显色5分钟，脱水、透明、DPX 封片。免疫组织化学检测对照∶用血清稀释液代替一抗，其余步骤同前。

　　核蛋白的提取

　　使用Active Motif公司的核蛋白提取试剂盒，方法参照使用手册。

　　核蛋白与DNA探针的结合及电泳

　　向小管中加入2 ×buffer (mmol/L: Tris 40.0; MgCl2 10.0; KCl 200.0; EDTA 2.0; DTT 2.0; BSA 2 mg/ml;甘油14%(v/v))10 μl，Poly(dI-dC)-Poly(dI-dC)110 μg，加水至18 μl，加入核提取物1-5 μl，混匀，室温放置10分钟。向每份样品中加入32P2DNA 探针2 μl，混匀，电泳(8 %聚丙烯酰胺凝胶电泳)。干胶后进行放射自显影。

　　NF-κB活性测定

　　用美国Motif公司的TrasAM P65试剂盒进行测定，首先使样本中的NF-κB和96孔板上包被的寡苷酸结合;室温孵育1小时，洗板3次，结合一抗，室温静置孵育1小时，洗板3次，结合二抗，室温静置孵育1小时，洗板4次，加入显色剂显色，室温避光孵育5分钟，然后每孔加100 μl终止液，此时蓝色变黄，5分钟内读板，设定波长为450 nm。

　　统计学处理

　　所得结果数据用X±SD表示，采用SPSS 12.0分析，设立对照组，多组间比较采用双因素重复试验方差分析，多组间两两比较采用SNK检验，P<0.05为有显著意义。

　　结果

　　骨髓基质细胞形态及生长情况

　　接种1天内，培养瓶中以悬浮细胞居多，逐渐可观察到大部分单个核细胞贴壁，呈圆形、椭圆形或多角形。第5天换液后，非骨髓基质细胞成份大多破裂死亡，细胞呈梭形。6-8天后，随培养、换液进行，造血细胞成分基本消失，贴壁细胞逐渐成细胞集落，集落中的细胞不断扩增，呈放射状向周围扩展. 第14、15天，细胞集落逐渐与邻近集落融合，交错成片。

　　根据细胞数目的扩增情况作曲线图。从细胞生长曲线图中可以明显看出细胞在短期的休眠后很快进入对数生长期，细胞生长旺盛，增殖速度明显加快。

　　不同浓度的氢醌作用不同时间对细胞活力的影响

　　台盼蓝染色发现，浓度为0.1 μmol/L的HQ处理骨髓基质细胞不超过24小时，活细胞百分数即台盼蓝拒染率很高，与空白对照组无差异(P>0.05)，提示此浓度氢醌对细胞活性无明显影响;但随时间延长及氢醌浓度增高，0.1 μmol/L氢醌作用72小时组及1、10和100 μmol/L氢醌作用0-72小时，活细胞百分数随时间和氢醌浓度增高而逐渐下降，提示细胞活力降低;100 μmol/L组，作用12小时以上，细胞拒染率明显降低，死亡细胞数已多于活细胞数，提示药物浓度过量。

　　不同浓度的PMA对骨髓基质细胞NF-κB活性的影响

　　实验结果表明，PMA (2 ng/mL)可显著活化细胞核内NF-κB。

　　NF-κB免疫组织化学检测结果

　　结果如图3所示，正常培养的BMSC，用稀释血清代替一抗，P65蛋白位于细胞浆内、细胞核周围，S-P染色呈弱阳性;加入细胞激活剂PMA 12小时后，P65蛋白转移入细胞核内，染色呈强阳性;而PMA和氢醌同时加入组P65蛋白位于胞浆内，染色呈弱阳性，这一结果证实了氢醌的抑制作用。

　　NF-κB活性指标

　　与对照组比较，随着HQ浓度增高，NF-κB活性逐渐降低(P<0.05)，浓度为100 μmol/L，作用72小时时HQ的抑制作用最显著。

　　讨论

　　本实验通过不同浓度的氢醌作用于骨髓基质细胞不同时间的台盼蓝染色发现，浓度为0.1 μmol/L的HQ处理骨髓基质细胞不超过24小时，活细胞百分数即台盼蓝拒染率很高，提示低浓度短时间作用下氢醌对细胞活性无明显影响;但随时间延长及氢醌浓度增高，0.1 μmol/L氢醌作用72小时组及1、10和100 μmol/L氢醌作用0-72小时，活细胞百分数随时间和氢醌浓度增高而逐渐下降，提示高浓度长时间作用下氢醌对骨髓基质细胞有明显毒性作用。

　　用蛋白酶C激活物PMA作为激活剂，通过磷酸化途径激活NF-κB。在无氢醌作用的情况下免疫组织化学测定显示，NF-κB被激活，大量进入核内，染色呈强阳性，而与之相比较，当有氢醌作用时，这种激活作用被抑制，免疫组织化学测定呈弱阳性。这一结果证实了氢醌对PMA引起的NF-κB激活有抑制作用。进一步实验证实，氢醌对NF-κB活性抑制具有明显的量效和时间关系。

　　苯及其代谢产物对造血组织的毒效应不仅表现在抑制造血干细胞的增殖上，而且还引起造血微环境的异常。本研究发现了苯对造血微环境损伤的一种可能机制，可为进一步研究苯相关再生障碍性贫血等血液病提供分子学实验依据。

　　【参考文献】

　　1 Anonymous. Benzene. IARC Monogr Eval Carcinog Risk Chem Hum，1982，29:93-148

　　2 Marcus WL. Chemical of current interest-benzene. Toxicol Ind Health，1987; 3:205-266

　　3 Schlosser PM，Bond JA，Medinsky MA，et al. Benzene and phenol metabolism by mouse and rat liver microsomes. Carcinogenesis，1993; 14:2477-2486

　　4 Snyder R. Recent developments in the understanding of benzene toxicity and leukemogenesis. Drug Chem Toxicol，2000; 23:13-25

　　5 邓加栋，杨崇礼，杨天楹等主编. 邓家栋临床血液学，上海：上海科学技术出版社. 2001:465-469

　　6 司徒镇强，吴军正. 细胞培养. 西安: 世界图书出版西安公司，1996: 145-146

　　7 Kerzic PJ，Pyatt DW，Zheng JH， et al. Inhibition of NF-κB by hydroquinone sensitizes human bone marrow progenitor cells to TNF-α-induced apoptosis. Toxicology，2003; 187: 127-137

　　8 Ogata N，Yamamoto H，Kugiyama K，et al. Involvement of protein kinase C in superoxide anion-induced activation of nuclear factor-κB in human endothelial cells. Cardiovasc Res，2000; 45: 513-521

　　9 Pyatt DW，Stillman WS，Irons RD. Hydroquinone，a reactive metabolite of benzene，inhibits NF-κB in primary human CD4 T lymphocytes. Toxicol Appl Pharmacol，1998; 149: 178-184.