多参数流式细胞术在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用

　　作者：陆伟,丁润生,姜胜华,陈秀芳　　作者单位：南通大学附属医院血液病研究室，南通

　　【摘要】目的：探讨多参数流式细胞术在非霍奇金淋巴瘤(NHL)中的诊断价值。方法：对临床疑似淋巴瘤患者的30份淋巴结行病理学常规及免疫组化检查，已确诊NHL患者的71份骨髓和血液标本行常规细胞形态及组化染色。对所有标本制备单个细胞悬液，进行多参数流式细胞术(FCM)免疫表型分析。结果：(1)淋巴结常规病理中5例误诊或无法分类的病例，经FCM检测诊断明确。通过流式细胞免疫表型分析与淋巴结病理诊断相结合，准确率由78.6%(22/28例)提高到96.4%(27/28例);(2)49例NHL患者骨髓形态学经FCM的免疫表型分析获得进一步确诊和分型。同时，流式细胞免疫表型分析使NHL骨髓浸润检测的阳性率提高了22.7%。结论：FCM能进一步明确NHL和NHL骨髓浸润的诊断与鉴别诊断，提高诊断的准确率。

　　【关键词】 非霍奇金淋巴瘤,流式细胞术,免疫表型

　　[Abstract] Objective： To investigate the value of multiple parameter flow cytometry in diagnosis of Non-Hodgkin's lymphoma(NHL). Methods: 30 lymph nodes from patients with suspected lymphoid malignancies were tested by pathological and immunohistochemical methods, 71 samples of bone marrow from confirmed lymphoid malignancies were tested by routine morphology and histochemical staining. All samples were analyzed by FCM in suspended single cell. Results:(1)Five of 28 lymph nodes, which failed to be diagnosed by routine methods, were determined by flow cytometric immunophenotype analysis. FCM combind with pathological method would raise the accuracy, which raised from 78.6% to 96.4%; (2)Immunophenetype of 49 cases of NHL was further confirmed by FCM. The positive rate of NHL with bone marrow involvement was raised 22.7%, compared with routine morphology. Conclusion: Multiple parameter analysis by FCM can further ascertain the diagnosis and differential diagnosis of NHL and NHL with bone marrow involvement. It can raise the diagnosis accuracy.

　　[Key words] Non-Hodgkin's lymphoma; Flow cytometry;Immunophenotype

　　淋巴瘤诊断方法包括病理形态、免疫组化、细胞遗传学和基因诊断，目前常用的是病理形态学诊断和免疫组化。而免疫组化操作技术复杂，耗时长。要达到理想的诊断和鉴别诊断必须依赖新的技术方法[1]。我们将流式细胞术(flow cytometry， FCM)用于淋巴肿瘤细胞的生物学特性分析，旨在提高恶性淋巴瘤诊断的效率和准确率，为快速、准确诊断与鉴别诊断淋巴瘤提供客观检测指标。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源 30份颈部或腋窝淋巴结标本来自2004年5月~2007年12月于本院门诊就诊或住院的疑似淋巴瘤患者。71份骨髓标本来自已确诊的非霍奇金淋巴瘤患者，其中男50例，女21例，中位年龄为48岁。

　　1.2 方法

　　1.2.1 形态学检查 对临床疑似淋巴瘤患者30份淋巴结作病理形态学和免疫组化染色检查，选择的单抗有CD5、CD3、TDT、CD10、CD20、CD79a、LCA、UCHL-1、Bcl-2等。71份骨髓涂片经瑞氏及组化染色，行形态学检查。

　　1.2.2 流式细胞仪检测 所有标本均行流式细胞术免疫表型分析。淋巴结采用机械剪切法制备细胞悬液，骨髓标本以Ficoll液分离单个核细胞。按FCM表面抗原和胞内抗原常规方法标记。用于免疫表型分析的单抗包括B细胞系的CD19、CD10、CD20、CD22、Kappa、Lambda;T/NK系的CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD57、CD3、CD4、CD8、TCRαβ、TCRγδ;髓系单抗CD33;无系列特异性及用于类型诊断的单抗TDT、CD45、CD38、CD11c、CD34、CD138、CD25、CD23等。骨髓以CD45/SSC设门，淋巴结先以 Kappa/Lambda /19三标，观察有无B细胞克隆性增殖。若确定为B系克隆性增殖，则用CD19/SSC设门，若排除B系克隆性增殖则用CD45/SSC设门。表型分析参照WHO 2000年恶性淋巴瘤分类法[2，3]。所有荧光单抗和溶血剂、破膜剂均购自BD公司和贝克曼-库尔特公司。流式细胞仪购自美国BD公司。

　　2 结 果

　　2.1 淋巴结病理诊断与FCM结果的比较 除2例霍奇金淋巴瘤外，28例中22例FCM结果与淋巴结活检病理和免疫组化相符，符合率为78.6%(22/28例)。在6例不相符的病例中，1例病理诊断为反应性增生，FCM诊断为B小淋巴细胞淋巴瘤其免疫表型如图1;1例病理诊断为滤泡性淋巴瘤可能，FCM确诊为套细胞淋巴瘤;1例病理诊断为Burkitt's淋巴瘤，FCM确诊为B淋巴母细胞淋巴瘤;1例病理诊断不明的B细胞肿瘤，FCM诊断为套细胞淋巴瘤;另2例分类不明的T细胞肿瘤，1例FCM诊断为T淋巴母细胞淋巴瘤，1例FCM也未能明确诊断。

　　2.2 骨髓形态学和FCM结果的比较 71份确诊为非霍奇金淋巴瘤患者的骨髓标本经形态学检测，按FAB分型初步诊断为慢性淋巴细胞白血病15例，毛细胞白血病2例，幼淋细胞白血病1例，浆细胞瘤/骨髓瘤8例，FCM结果与形态学检查相符。大颗粒淋巴细胞白血病1例，经FCM分析确定为T-大颗粒淋巴细胞白血病。在另外44份骨髓标本中，形态见到肿瘤细胞有22例，经FCM进一步分析，发现B-NHL骨髓浸润18例，T/NK NHL骨髓浸润的4例;在血液和骨髓形态学检查未见肿瘤细胞的22例中，FCM检测到肿瘤细胞5例，其中B系肿瘤4例，T/NK系肿瘤1例。余17例未发现淋巴瘤细胞。

　　3 讨 论

　　淋巴瘤是常见的实体瘤，也是病理学诊断难度最大的疾病之一，淋巴瘤不仅具有自己的形态学特点，还有特有的免疫表型。虽然免疫组化染色对淋巴瘤的诊断及分型有着重要意义，但由于多重标记较困难，使其在淋巴瘤诊断及分型中的应用受到了限制。NHL病理分型、免疫表型与诊断、治疗及预后关系密切。FCM尤其在B-NHL的诊断及分型中具有优势。我们将轻链K∶λ的比值大于10∶1或低于1∶10定为B细胞克隆性增殖[4]。有人曾用FCM与PCR技术对NHL的克隆性进行了比较观察，发现前者通过克隆性检测能对98%的病例作出明确诊断，而后者仅对68%的病例起显示诊断作用，而对T/NK淋巴瘤，PCR的诊断比FCM要敏感，前者为71%，后者仅29%。

　　本实验采用20多种白细胞分化抗原的单抗，结合多参数流式细胞术，分析了99份淋巴结、骨髓、外周血标本的抗原表达情况，结果表明：(1)通过流式免疫表型分析与病理相结合，28例病理诊断中5例误诊或不能明确诊断者，经流式分析后明确诊断，诊断准确率由78.6%(22/28)提高到96.4%(27/28);(2)通过流式细胞术免疫表型分析非霍奇金淋巴瘤的骨髓或外周血，不仅进一步提示细胞的来源、分化阶段，而且提高了非霍奇金淋巴瘤患者骨髓标本中的肿瘤细胞检测的敏感性，与骨髓形态学相比，流式细胞免疫表型分析能使NHL骨髓浸润检测的阳性率提高22.7%。

　　由此可见，多参数流式细胞术在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用比传统的病理形态学诊断具有不可替代的作用，有条件的医院应常规开展该项技术。

　　【参考文献】

　　[1] Evans LS, Hancock BW. Non-Hodgkin lymphoma[J]. Lancet，2003，362(9378)：139-146.

　　[2] Vardiman JW, Harris NL, Brunning RD. The World Health Organization(WHO) classification of the myeloid neoplasms[J]. Blood,2002,100(7):2292-2302.

　　[3] 李甘地，刘卫平. 从争论到统一—介绍WHO新的恶性淋巴瘤分类[J]. 中华病理学杂志,2001, 20 (2):137-140.

　　[4] Palacio C,Acebedo G, Navarrete M, et al. Floe cytometry in the bone marrow evalution of follicular and diffuse large B-cell lymphomas [J]. Haematologica,2001,86(9):943-940.